陜 光

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿Ⅱ科 武漢430060）

膀胱尿路上皮癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，也是全身十大常見腫瘤之一。占我國(guó)泌尿生殖系腫瘤發(fā)病率的第一位，而在西方其發(fā)病率僅次于前列腺癌，居第2位。膀胱尿路上皮癌其生物學(xué)行為有多中心、易復(fù)發(fā)、及浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的特點(diǎn)。膀胱癌的病因復(fù)雜，既有內(nèi)在的遺傳因素，又有外在的環(huán)境因素。因此進(jìn)一步研究膀胱癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找能夠有效預(yù)測(cè)其生物學(xué)行為的指標(biāo)，對(duì)其早期診斷、指導(dǎo)治療和預(yù)后具有重要的意義。

胰島素樣生長(zhǎng)因子－1受體（Isulin－like growth factor 1recep tor（IGF－1R）是具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化等多種生物活性的生長(zhǎng)因子。研究表明其參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，與癌基因及其他細(xì)胞因子相互作用促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，而且在基因的靶向治療中也顯示出優(yōu)越性［1－3］。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類依賴鋅離子的具有催化活性的蛋白質(zhì)，它主要通過水解細(xì)胞外周基質(zhì)成分從而保持組織中內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，在癌組織中變異的蛋白水解作用導(dǎo)致腫瘤的惡化，組織的重塑，炎癥，組織侵襲和轉(zhuǎn)移［4，5］。

采用免疫組化和圖像分析方法檢測(cè)和分析了膀胱尿路上皮癌組織中IGF－1R和MMP－2蛋白的表達(dá)以及二者的表達(dá)與膀胱尿路上皮癌臨床病理因素的關(guān)系，有望能為膀胱尿路上皮癌的診治提供新的靶點(diǎn)。

材料和方法

1.材料

1.1 收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科2000－2006年膀胱尿路上皮癌存檔蠟塊50例（均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為膀胱尿路上皮癌），其中男性38例，女性12例，平均年齡50.3歲，另5例癌旁組織距瘤緣3－5cm。標(biāo)本均經(jīng)HE染色，光鏡觀察診斷，按WHO尿路腫瘤組織學(xué)分類（2004），浸潤(rùn)性尿路上皮癌30例，非浸潤(rùn)性乳頭狀尿路上皮癌；高級(jí)別15例，低級(jí)別5例；按 UICC臨床分期，T1 31例，T2 11例，T3－4 8例。其中未經(jīng)化療的初發(fā)腫瘤28例，化療后復(fù)發(fā)腫瘤22例。

1.2 主要試劑

1.2.1 即用型兔抗人IGF－1R多克隆抗體；（北京中杉生物技術(shù)有限公司）

1.2.2 即用型兔抗人 MMP－2多克隆抗體；（北京中杉生物技術(shù)有限公司）

1.2.3 超敏即用型SP通用型免疫組織化學(xué)試劑盒；（北京中杉生物技術(shù)有限公司）

1.2.4 DAB顯色試盒及多聚賴氨酸 （北京中杉生物技術(shù)有限公司）

2.方法

2.1 HE染色

常規(guī)取材、固定、脫水、透明、包埋、切片、HE染色及封片。

2.2 免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)IGF－1R 和MMP－2蛋白相關(guān)抗原

具體步驟：4μm組織切片常規(guī)脫蠟至水后，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗3×3min；抗原修復(fù)（檸檬酸緩沖液微波抗原修復(fù)法），室溫自然冷卻后，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗5×3min；滴加3%過氧化氫，37℃濕盒孵育10min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗3×3min；正常羊血清37℃濕盒孵育10min以減少非特異性背景；甩去多余血清，分別滴加一抗，4℃孵育過夜，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗3×5min；滴加生物素標(biāo)記的二抗37℃濕盒孵育10min，0.01mol／LPBS（pH 7.4）漂洗3×3min；滴加鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物復(fù)合物37℃濕盒孵育10min，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗3×3min；滴加新鮮配置的DAB顯色液顯色，光鏡下控制反應(yīng)時(shí)間（約3－5min），自來水沖洗終止反應(yīng)；蘇木素復(fù)染，流水沖洗，1%鹽酸酒精分色數(shù)秒，流水沖洗，0.1%氨水返藍(lán)；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片并鏡檢；用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照組，購(gòu)買的陽性片作為IGF－1R和MMP－2的陽性對(duì)照組。

2.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷

2.3.1 IGF－1R 和 MMP－2以細(xì)胞質(zhì)或胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，陰性對(duì)照組除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，應(yīng)無棕黃色反應(yīng)物。

2.3.2 采用HPIAS－1000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告管理系統(tǒng)（同濟(jì)千屏影像公司）對(duì)IGF－1R和MMP－2的表達(dá)進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測(cè)定每個(gè)視野下陽性反應(yīng)的平均光密度、陽性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積，計(jì)算陽性面積率。以每例5個(gè)視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測(cè)量值。（陽性面積率＝單位面積中陽性反應(yīng)的總面積／單位面積中細(xì)胞的總面積×100%）

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 對(duì)各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率作單因素方差分析和q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。IGF－1R和 MMP－2蛋白在不同分組中的表達(dá)情況及二者在膀胱尿路上皮癌各臨床病理因素之間表達(dá)差異采用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法。

結(jié) 果

1.IGF－1R的表達(dá)

膀胱尿路上皮癌胞膜或胞質(zhì)中可見較多棕黃色顆粒，IGF－1R呈陽性表達(dá)（圖1）；癌旁組織胞膜或胞質(zhì)中可見少量的棕黃色顆粒，IGF－1R表達(dá)弱，呈陰性表達(dá)（圖2）。圖像分析結(jié)果見表1。經(jīng)q檢驗(yàn)，膀胱尿路上皮癌與癌旁組織之間，IGF－1R的平均光密度及陽性面積率有顯著性差異（P＜0.05）（表1）。

表1 膀胱尿路上皮癌和癌旁組織IGF－1R表達(dá)的平均光密度和陽性面積率（）Table 1 The average optical density and the rate of positive area of IGF－1Rin Bladder Urothelial Cancer and cancer side tissue（）

表1 膀胱尿路上皮癌和癌旁組織IGF－1R表達(dá)的平均光密度和陽性面積率（）Table 1 The average optical density and the rate of positive area of IGF－1Rin Bladder Urothelial Cancer and cancer side tissue（）

＊ 膀胱尿路上皮癌與癌旁組織比較（comparison between Bladder Urothelial Cancer and cancer side tissue）P＜0.05

ositive area膀胱尿路上皮癌Bladder Urothelial Cancer 50 0.3681±0.0075＊組別Group例數(shù)n平均光密度Average optical density陽性面積率Rate of p 0.3783±0.0076癌旁組織Cancer side tissue 5 0.0682±0.0032 0.0702±0.0033

2.MMP－2蛋白的表達(dá)

膀胱尿路上皮癌胞膜或胞質(zhì)中可見密集分布的棕黃色顆粒，MMP－2蛋白表達(dá)強(qiáng)（圖3）；癌旁組織胞膜或胞質(zhì)中可見少量或無棕黃色顆粒，MMP－2蛋白呈弱陽性或陰性表達(dá)，（圖4）。圖像分析結(jié)果見表2。經(jīng)q檢驗(yàn)，膀胱尿路上皮癌與癌旁組織之間，MMP－2蛋白的平均光密度及陽性面積率有顯著性差異（P＜0.05）（表2）。

表2 膀胱尿路上皮癌和癌旁組織MMP－2表達(dá)的平均光密度和陽性面積率（）Table 2 The average optical density and the rate of positive area of MMP－2 in Bladder Urothelial Cancer and cancer side tissue（）

表2 膀胱尿路上皮癌和癌旁組織MMP－2表達(dá)的平均光密度和陽性面積率（）Table 2 The average optical density and the rate of positive area of MMP－2 in Bladder Urothelial Cancer and cancer side tissue（）

＊ 膀胱尿路上皮癌與癌旁組織比較（comparison between Bladder Urothelial Cancer and cancer side tissue）P＜0.05

ositive area膀胱尿路上皮癌Bladder Urothelial Cancer組別Group例數(shù)n平均光密度Average optical density陽性面積率Rate of p 50 0.3012±0.0059 0.3112±0.0063癌旁組織Cancer side tissue 5 0.0801±0.0034 0.0789±0.0033

3.IGF－1R和MMP－2的表達(dá)與膀胱癌臨床分 期的關(guān)系，結(jié)果見表3。

表3 IGF－1R、MMP－2的表達(dá)與膀胱尿路上皮癌臨床分期的關(guān)系Table 3 The expression of IGF－1Rand MMP－2with the correlation of TNM stag of Bladder Urothelial Cancer

4.IGF－1R和MMP－2的表達(dá)與膀胱尿路上皮 癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，結(jié)果見表4。

表4 IGF－1R和MMP－2的表達(dá)與膀胱尿路上皮癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系Table 4 The expression of IGF－1Rand MMP－2with the correlation of LymPh nodemetastasi of Bladder Urothelial Cancer

5.IGF－1R 和 MMP－2的表達(dá)與腫瘤大小關(guān) 系，結(jié)果見表5。

表5 IGF－1R和MMP－2的表達(dá)與腫瘤大小關(guān)系Table 5 The expression of IGF－1Rand MMP－2with the correlation of tumor size and Pathologic type of Bladder Urothelial Cancer

表6 IGF－1R、MMP－2的表達(dá)與性別、年齡、病理類型等的關(guān)系Table 6 The expression of IGF－1and RMMP－2with the correlation of sex、age and Pathologic type of Bladder Urothelial Cancer

6.IGF－1R、MMP－2的表達(dá)與性別、年齡、病理 類型等的關(guān)系，結(jié)果見表6。

討 論

膀胱癌是我國(guó)泌尿外科腫瘤中的發(fā)病率和死亡率均占首位，近年來發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。約2／3的膀胱癌為淺表性、易復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)后70%－80%不發(fā)生肌層浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后較好，而20%－30%將進(jìn)展為浸潤(rùn)性腫瘤；另1／3的膀胱癌較早發(fā)生肌層浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后差。早期診斷膀胱癌并根據(jù)其生物學(xué)特點(diǎn)采取及時(shí)合理的治療方法，一直是泌尿外科學(xué)者研究的重要課題。近年來，人們認(rèn)識(shí)到細(xì)胞凋亡在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要作用。

胰島素樣生長(zhǎng)因子－1受體（insulin like growth factor 1recep tor，IGF－1R）系IGFs家族成員，為一種跨膜的酪氨酸蛋白受體，在神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤、肝細(xì)胞癌、乳腺癌、腎上腺皮質(zhì)腫瘤及肺癌中均有高表達(dá)，且通過與其配體結(jié)合對(duì)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等產(chǎn)生重要影響［6－9］?，F(xiàn)已在多種腫瘤中檢測(cè)到IGF－1R的表達(dá)。研究表明IGF－1R在多種腫瘤中的表達(dá)上調(diào)，并通過促進(jìn)細(xì)胞增埴，抑制細(xì)胞凋亡，與其他生長(zhǎng)因子如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF－C）的信號(hào)通路相互作用實(shí)現(xiàn)促瘤作用，與誘導(dǎo)和保持腫瘤細(xì)胞的表型及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。胰島素樣生長(zhǎng)因子系統(tǒng)（IGFS）是一類與胰島素高度同源的多肽生長(zhǎng)因子，近年來的研究已證實(shí)IGFS在腦癌、前列腺癌等的癌細(xì)胞中過度表達(dá)。IGFS的大多數(shù)生物學(xué)活性主要由IGF－1R來介導(dǎo)，IGF－1及其受體與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系緊密［10－14］。IGF－1可通過多種形式被調(diào)節(jié)。IGF－2 可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞通過以自分泌和旁分泌的形式分泌IGF－2，IGF－2可以激活1型受體，調(diào)節(jié)對(duì)組織的增殖和分化作用。

MMP－2是基質(zhì)金屬蛋白酶的主要家庭成員，可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，參與多種生理和病理過程，在細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子的作用下，參與了腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成等環(huán)節(jié)。MMP－2主要通過降解Ⅳ型膠原纖維而起作用，而Ⅳ型膠原纖維則是細(xì)胞膜及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的主要組成成分。除此之外還可以降解纖維連接蛋白、層粘連蛋白、蛋白多糖連接蛋白、多功能蛋白聚糖、聚集蛋白聚糖、彈力蛋白及骨結(jié)核素等非膠原細(xì)胞外基質(zhì)。許多腫瘤細(xì)胞不僅可以自身表達(dá) MMP－2還能誘導(dǎo)臨近的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生 MMP－2［15－17］。

本研究發(fā)現(xiàn)：IGF－1R和 MMP－2在膀胱尿路上皮癌中呈高表達(dá)，提示IGF－1R和 MMP－2可能與膀胱尿路上皮癌的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)；IGF－1R和 MMP－2在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)水平與膀胱尿路上皮癌的病理分級(jí)有關(guān)，表明膀胱尿路上皮癌惡性程度越高IGF－1R和MMP－2的表達(dá)水平越高；IGF－1R和 MMP－2在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)水平與膀胱尿路上皮癌的臨床分期有關(guān)，表明膀胱尿路上皮癌分期越晚IGF－1R和 MMP－2表達(dá)水平越高。膀胱尿路上皮癌IGF－1R和 MMP－2與膀胱尿路上皮癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)，膀胱尿路上皮癌組織中IGF－1R的高表達(dá)和 MMP－2的高表達(dá)二者協(xié)同作用可能促進(jìn)腫瘤的演進(jìn)。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)IGF－1R和MMP－2在不同腫瘤體積大小、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移，不同病理分級(jí)和臨床分期中的表達(dá)，都與上述變化相關(guān)，但與患者的性別、年齡及腫瘤的病理分型無關(guān)。由此可見，IGF－1R和 MMP－2與膀胱尿路上皮癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)，同時(shí)檢測(cè)這兩種蛋白的表達(dá)可以對(duì)膀胱尿路上皮癌惡性程度的判定及進(jìn)一步治療提供理論依據(jù)。

由此可見，IGF－IR和MMP－2的高表達(dá)可以促進(jìn)正常細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，對(duì)膀胱尿路上皮癌細(xì)胞可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。

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圖 版 說 明

圖1 IGF－1R的表達(dá) 膀胱尿路上皮癌胞膜內(nèi)可見較多棕黃色顆粒（→），IGF－1R表達(dá)強(qiáng)（S－P×200）。

圖2 IGF－1R的表達(dá) 癌旁組織胞質(zhì)內(nèi)可見少量的棕黃色顆粒（→），IGF－1R表達(dá)弱（S－P×200）。

圖3 MMP－2蛋白的表達(dá)膀胱尿路上皮癌胞核和胞漿內(nèi)可見較多棕黃色顆粒，MMP－2蛋白表達(dá)強(qiáng)（S－P×200）。

圖4 MMP－2的表達(dá) 癌旁組織胞核和胞漿內(nèi)可見少量的棕黃色顆粒，MMP－2表達(dá)弱（S－P×200）。

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1IGF－1Rexpression in Bladder Urothelial Cancer There were plenty of brown particles in the cell membrane，which showed IGF－1Rexpressed strongly.S－P×200

Fig.2IGF－1Rexpression in cancer side tissue.There were few brown particles in the cell membrane，which showed IGF－1Rexpressed weakly.S－P×200

Fig.3MMP－2expression in Bladder Urothelial Cancer .There were plenty of brown particles in the nuclear or cytoplasmic，which showed MMP－2expressed strongly.S－P×200

Fig.4MMP－2expression in cancer side tissue.There were few brown particles in the nuclear or cytoplasmic，which showed MMP－2expressed weakly.S－P×200