唐念珍 唐成林＊ 楊 輝 張 毅 田 源 謝 輝 陳曉琳

（1重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院 重慶400016；2重慶醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院 重慶400016）

胰島素抵抗（Insulin resistance，IR）是胰島的分泌功能正常，而胰島素作用的主要靶器官組織（如肌肉、肝臟、脂肪組織等）對一定劑量的胰島素所產(chǎn)生的生理效應(yīng)低于原本正常水平的一種狀態(tài)［1］。葡萄糖轉(zhuǎn)運子4（GLUT4）和糖原合酶激酶－3β（glycogen synthase kinase－3β，GSK－3β）是胰島素信號傳導(dǎo)下游通路上的重要影響因子，GLUT4是骨骼肌進行葡萄糖轉(zhuǎn)運的主要載體蛋白，它僅能在胰島素的刺激下，才能通過易位作用將葡萄糖轉(zhuǎn)運到細胞膜上，促進葡萄糖的攝取和代謝［2］。其數(shù)目的減少，內(nèi)在活性的降低或轉(zhuǎn)位的障礙，均可導(dǎo)致骨骼肌對葡萄糖的攝取減少，胰島素的敏感性下降，從而產(chǎn)生IR［3－4］。GSK－3β是一種絲氨酸／蘇氨酸激酶，是胰島素作用的關(guān)鍵負性調(diào)節(jié)因子，主要通過使糖原合酶磷酸化而失活，進而阻止糖原的合成，導(dǎo)致血糖升高，進而產(chǎn)生IR［5］?，F(xiàn)階段研究針刺治療胰島素抵抗大多是對胰島素信號通路的上游因子（如PI3K等）的研究，而其對下游通路影響因子的研究相對缺乏。本課題組在此之前研究已證實，電針能夠降低肥胖大鼠脂肪組織中CRP和IL－6等的表達，改善肥胖大鼠機體的炎癥反應(yīng)狀態(tài)，而炎癥反應(yīng)與IR是息息相關(guān)的［6－9］。本研究通過觀察胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游影響因子GLUT4和GSK－3βmRNA表達量的變化，探討電針改善IR大鼠胰島素抵抗狀態(tài)。

材料和方法

1.材料

1.1 動物

健康清潔級4周齡雄性SD大鼠70只，體重80－100g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（醫(yī)學(xué)動物合格證SCXK（渝）2012－0002）。

1.2 主要試劑及儀器

葡萄糖氧化酶試劑盒（中國上海榮盛生物藥業(yè)公司）；大鼠INS ELISA試劑盒（美國R＆D公司）；AU2700全自動生化分析儀（重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院）；RNA 提取試劑（Trizol）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）試劑盒（日本Takara）；SYBR？倕 Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒（日本 Takara）；MX3005P熒光定量PCR儀（重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院）；華佗牌針灸針（0.25mm×13mm，中國蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；SDZ－Ⅱ型電子針療儀（中國蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。

2.方法

2.1 胰島素抵抗大鼠模型制備及分組

健康清潔級雄性SD大鼠70只，4周齡，體重80－100g。25℃左右恒溫，濕度50%左右，明暗周期12h環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后，隨機選取10只大鼠飼以普通飼料，為普食組（common diet group，CD，n＝10），其余60只飼以高脂高糖飼料，為模型組。飼料配方參考王艷軍等［10］經(jīng)實驗驗證的配方：基礎(chǔ)飼料60%、豬油15%、蔗糖25%，基礎(chǔ)飼料為重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心配制。每周同一時間各組大鼠稱重一次。從第5w開始，每周對普食組和模型組大鼠從眼眶靜脈竇采血1次，檢測FPG、INS，并計算ISI，ISI參照李光偉等［11］方法：ISI＝1／（空腹血糖×空腹胰島素），因其為偏態(tài)分布 ，故取自然對數(shù)比較。8w后，以FPG、INS均較普食組顯著升高（P＜0.01），ISI顯著下降（P＜0.01）為胰島素抵抗模型大鼠造模成功納入標準，最終得到胰島素抵抗大鼠44只。從中篩選40只隨機分為4組：繼續(xù)給予高脂高糖飲食的為高脂高糖1組（high－fat and high－carbohydrate diet 1，HFC 1，n＝10），轉(zhuǎn)為普食喂養(yǎng)的為高脂高糖2組（high－fat and high－carbohydrate diet 2，HFC 2，n＝10），給予高脂高糖飲食和電針治療的為電針1組（electroacupuncture 1，EA 1，n＝10），給予普食和電針治療的為電針2組（electroacupuncture 2，EA 2，n＝10）。

2.2 治療方法

每天早上9：00將各組大鼠固定于實驗臺上，針刺雙側(cè)足三里、三陰交，胃脘下俞，毫針勻速進針，足三里、三陰交斜刺5mm，胃脘下俞斜刺3mm，同側(cè)足三里和胃脘下俞接通電針儀，每天一次，每次20 min，連續(xù)針刺2w。穴位定位參照李忠仁《實驗針灸學(xué)》［12］大鼠穴位的定位方法：足三里（后三里）位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下約5mm處；三陰交位于后肢內(nèi)踝尖直上10mm；胃脘下俞位于背部第8胸椎下，旁開5mm。電針參數(shù)的選擇參照本課題組前期的研究結(jié)果：疏密波，頻率20Hz，3mA（中等強度刺激）［8］。普食組、高脂高糖1組和高脂高糖2組不進行電針治療，但進行固定，以排除大鼠應(yīng)激等因素導(dǎo)致的實驗偏差。

2.3 取材方法

各組大鼠禁食12h，10%水合氯醛（0.3ml／100g）腹腔注射麻醉，切開股四頭肌皮膚及皮下，止血鉗鈍性分離肌肉組織，并切割為2塊大小約為1.0cm×0.5cm×0.5cm的標本，置于液氮中轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱凍存待測。切開腹部，剪破膈肌，用5ml注射器直接刺入心臟取血1ml，靜置20min，離心機3000r／min，離心10min，取血清待測。

2.4 檢測指標

2.4.1 大鼠體重檢測及日常行為活動觀察

每周三上午由固定人員檢測每只大鼠的體重，實驗前后觀察各組大鼠飲水量、進食量、大小便、精神及活動情況。

2.4.2 葡萄糖氧化酶法檢測血糖濃度

嚴格按照葡萄糖測定試劑盒說明書進行操作。提前配制工作液：將R1試劑（苯酚）和R2試劑（磷酸鹽緩沖液、4－氨基安替比林、葡萄糖氧化酶、過氧化物酶）等量混合均勻。取3支干燥試管，按照下表操作：

表1 葡萄糖氧化酶法加樣表Table 1 Adding sample list of glucose oxidase method

充分混勻，置于37℃水浴15min，用全自動生化分析儀在波長505nm下測定標準管和測定管的吸光度值（A）。計算方法：血清葡萄糖（mmol／L）＝（測定管吸光度／標準管吸光度）×5。

2.4.3 ELISA檢測血清胰島素濃度

應(yīng)用生物素雙抗體夾心法，按照ELISA試劑盒說明書進行操作。稀釋標準品，設(shè)空白對照孔，標準品孔加標準品50μl，鏈霉素－HRP50μl，待測樣品孔加入樣品40μl，抗－INS抗體10μl，鏈霉素－HRP50 μl。蓋上封板膜，輕輕震蕩混勻，37℃溫育60min。揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿配置洗滌液，靜置30s后棄去，重復(fù)5次，拍干。然后每孔先加入顯色液 A 50μl，再加入顯色液B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10min。每孔再加入終止液50μl，混勻后即刻用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），空白孔調(diào)零，通過標準曲線計算血清中INS含量。

2.4.4 實時熒光定量PCR測GLUT4和GSK－3βmRNA表達水平

于超凈工作臺上，將－80℃冰箱凍存的大鼠股四頭肌用液氮研磨至粉末，裝入無菌EP管，按Trizol總RNA試劑提取說明書提取組織總的RNA，提取好的反應(yīng)液放入紫外分光光度計測量RNA濃度及純度，確保 OD260／OD280比值在1.8－2.0之間。按 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄操作。目的基因及內(nèi)參基因序列通過檢索基因庫獲得，用Primer5設(shè)計引物，由Invitrogen Biotechnology中國公司合成。實時熒光定量PCR反應(yīng)按SYBR？倕 Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒操作步驟進行，擴增反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃變性1min，循環(huán)40次，95℃15s，58℃20s，72℃20s，72℃延伸5min；溶解曲線72℃到95℃，每20s升溫一次1℃。采用△△CT法計算結(jié)果：△△CT＝（CT目的基因－CT內(nèi)參基因）實驗組－（CT目的基因－CT內(nèi)參基因）對照組，目的基因的量＝2－△△CT。

表2 目的基因與內(nèi)參基因引物序列Table 2 Primer sequence of the target gene and reference gene

3.統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，用SPSS19.0進行統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析（One－way ANOVA），多組之間均數(shù)的兩兩比較采用Duncan多重檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.電針對胰島素抵抗模型大鼠體重的影響

如圖1所示，高脂高糖飲食喂養(yǎng)8w后，HFC組大鼠體重較CD組大鼠無顯著差異，說明IR與體重增加并無必然聯(lián)系。針刺治療14d后，HFC1組大鼠體重治療前后體重變化不明顯（P＞0.05），而HFC2組大鼠治療前后體重減輕明顯（P＜0.01），說明單純飲食控制對胰島素抵抗大鼠體重減輕有較為顯著的作用；EA1組較HFC1組體重明顯減輕，EA2組較HFC組體重也明顯減輕，提示電針在減輕IR大鼠體重上效果明確，在電針治療過程中配合飲食控制更可加強其控制體重的作用。

圖1 電針治療前后胰島素抵抗模型大鼠體重變化的比較Fig.1Effect of electroacupunctrue on body weight of the rats amongthe 5groups before and after treatmentaP＜0.01vs common diet（CD）group；b P＜0.01，c P＜0.01vs high－fat and high－carbohydrate diet 1（HFC1）group；d P＜0.01vs high－fat and high－carbohydrate diet 2（HFC2）group；e P＜0.05vs electroacupuncture 1（EA1）group

2.電針對胰島素抵抗模型大鼠血糖、胰島素、胰島素敏感指數(shù)的影響

如表1所示，高脂高糖組大鼠FPG、INS均較普食組明顯升高，而ISI顯著降低，提示大鼠有明顯的胰島素抵抗；EA組大鼠FPG、INS均較HFC組明顯降低，ISI顯著升高，提示電針在改善IR大鼠的FPG、INS、ISI上效果明顯；HFC2組較HFC1組FPG差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示單純飲食控制對胰島素抵抗模型大鼠FPG影響不明顯；HFC2組較HFC1組INS明顯降低，ISI明顯升高，EA2組較EA1組FPG、INS明顯降低，ISI明顯升高，提示在電針治療過程中配合飲食控制可加強其改善胰島素敏感性的作用。

表3 電針對胰島素抵抗模型大鼠血糖、胰島素、ISI的影響比較Table 3 Effect of electroacupunctrue on fasting blood glucose，insulin and ISI contents among 5 groups in insulin resistance rats after treatment

3.電針對胰島素抵抗大鼠骨骼肌GLUT4和GSK－3βmRNA表達量的影響

如圖2、圖3所示，HFC組GLUT4mRNA表達量明顯低于CD組，GSK－3βmRNA表達量明顯高于CD組，提示在IR大鼠骨骼肌中GLUT4mRNA表達量明顯減少，GSK－3βmRNA表達量明顯增多；EA組GLUT4mRNA表達量明顯高于HFC組，EA組GSK－3βmRNA表達量明顯低于HFC組，特別是EA 2組GSK－3βmRNA表達量與CD組比較無明顯差異（P＞0.05），提示電針在增強IR大鼠骨骼肌中GLUT4mRNA的表達和抑制GSK－3βmRNA的表達上有較顯著的作用；HFC2組較HFC1組GLUT4mRNA表達量變化不明顯（P＞0.05），而GSK－3βmRNA表達量顯著降低，提示單純飲食控制對提高IR大鼠GLUT4mRNA的表達量無顯著作用，對抑制GSK－3βmRNA的表達有較為顯著的作用；EA2組較EA1組，GLUT4mRNA表達量顯著升高，GSK－3βmRNA表達量顯著降低，提示飲食控制與電針治療結(jié)合可更好的改善大鼠胰島素抵抗。

圖2 電針對胰島素抵抗模型大鼠骨骼肌GLUT4mRNA表達量比較Fig.2Effect of electroacupunctrue on the content of GLUT4mRNA in insulin resistance rat skeletal muscle among the 5groupsaP＜0.01vs common diet（CD）group；b P＞0.05，c P＜0.01vs high－fat and high－carbohydrate diet 1（HFC1）group；d P＜0.01vs high－fat and high－carbohydrate diet 2（HFC2）group；e P＜0.01vs electroacupuncture 1（EA1）group

圖3 電針對胰島素抵抗模型大鼠骨骼肌GSK－3βmRNA表達量比較Fig.3Effect of electroacupunctrue on the content of GSK－3βmRNA in insulin resistance rat skeletal muscle among the 5groupsaP＜0.01vs common diet（CD）group；b P＜0.01，c P＜0.01vs high－fat and high－carbohydrate diet 1（HFC1）group；d P＜0.01vs high－fat and high－carbohydrate diet 2（HFC2）group；e P ＜0.01vs electroacupuncture 1（EA1）group

圖4 ① 目的基因GLUT4擴增曲線；②目的基因GLUT4溶解曲線；③目的基因GSK－3β擴增曲線；④目的基因GSK－3β溶解曲線；⑤內(nèi)參基因GAPDH擴增曲線；⑥內(nèi)參基因GAPDH溶解曲線Fig.4①GLUT4gene amplification curve；②GLUT4gene dissociation curve；③GSK－3βgene amplificationcurve；④GSK－3β gene dissociation curve；⑤GAPDH gene amplification curve；⑥GAPDH gene dissociation curve

討 論

胰島素抵抗（IR）作為糖尿病的主要發(fā)病機制，近年來已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注，但是卻一直欠缺良好的治療手段。電針對胰島素抵抗具有一定的改善作用［13］，而胰島素抵抗與炎癥是相輔相成的。本課題組前期研究已經(jīng)證實，電針可以減少肥胖大鼠脂肪組織中 CRP、IL－6、MCP－1、TNF－α等的表達，降低肥胖大鼠血清中TC、TG、LDL－C、FPG等的含量，從而改善肥胖大鼠機體的炎癥反應(yīng)狀態(tài)［6－9］。

胰島素的作用是通過胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的正常傳導(dǎo)來完成的。胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑目前已知至少有兩條：IR－IRS－PI3K途徑和MAPK途徑。而實驗證明了通過抑制MAPK的活性并不能降低胰島素引起的糖轉(zhuǎn)運和糖果原合成［14］，在IR狀態(tài)，IRIRS－PI3K途徑的作用下降，MAPK介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用仍則正常［15］。外源性胰島素（和）或葡萄糖刺激產(chǎn)生的胰島素使胰島細胞膜上的受體IRS活化后，與PI－3K結(jié)合使其活化，進而誘導(dǎo)無活性的Akt和PDK1從細胞質(zhì)移位到細胞膜，使PDK1獲得催化活性，使其自身磷酸化和Akt磷酸化，從而激活A(yù)kt。GSK－3β是Akt的直接底物，活化的Akt可使GSK－3β磷酸化而失活，導(dǎo)致糖原合成酶去磷酸化，從而糖原合成增加。GLUT4是骨骼肌和脂肪組織中最重要、受胰島素調(diào)節(jié)的葡萄糖轉(zhuǎn)運體［16］。而骨骼肌是胰島素作用的主要靶組織，約80%胰島素刺激的機體葡萄糖攝取是在骨骼肌進行的，機體胰島素的敏感性極大地依賴于骨骼肌葡萄糖的攝取量［17］。GLUT4基因敲除小鼠研究證實，在基礎(chǔ)狀態(tài)下，胰島素刺激或收縮刺激下，骨骼肌對葡萄糖轉(zhuǎn)運均明顯受損［18］。

當(dāng)機體發(fā)生IR時，機體本身分泌胰島素的功能正常，是其受體IRS與其結(jié)合的敏感度下降了，IRS的激活減少，從而PI3K的活化受到影響，進而引起Akt磷酸化減少，導(dǎo)致其下游因子GLUT4的激活也明顯減少，葡萄糖的轉(zhuǎn)運受損，血糖升高；而GSK－3β作為胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負性調(diào)節(jié)因子，可使糖原合成的關(guān)鍵因子糖原合成酶失活，而Akt可使其磷酸化而失活，當(dāng)Akt磷酸化減少時，GSK－3β的活性增加，從而使糖原合成酶失活率增加，糖原合成減少，血糖升高。

根據(jù)經(jīng)絡(luò)腧穴理論，足三里為足陽明胃經(jīng)之下合穴，三陰交為足太陰脾經(jīng)腧穴，也是足三陰經(jīng)的交會穴，脾主升清，胃主通降，為全身氣機升降之樞紐。胃脘下俞為經(jīng)外奇穴，位于足太陽膀胱經(jīng)背部第一側(cè)線上，大鼠第八胸椎棘突下旁開5mm。背俞穴是各內(nèi)臟器官生理或病理狀態(tài)時在體表背部的機能感應(yīng)點。不同的背俞穴對各自所屬的臟腑可產(chǎn)生十分明顯的影響，這和背俞穴與所屬臟腑之間存在密切的神經(jīng)分布一致性有關(guān)。胃脘下俞主要為T8神經(jīng)分布，T8主要是支配胰腺的傳入神經(jīng)，說明胃脘下俞與胰腺的神經(jīng)分布有高度的對應(yīng)性［19］。研究發(fā)現(xiàn)，針刺胃脘下俞有提高胰島素含量，降低血糖水平，改善胰島素敏感性的功效［20］。

本實驗研究以電針刺激胰島素抵抗模型大鼠“足三里”、“三陰交”、“胃脘下俞”穴為手段，以胰島素信號通路下游因子GLUT4和GSK－3β為觀測指標，探討電針改善胰島素抵抗模型大鼠胰島素抵抗的機制。實驗結(jié)果表明，8w后模型組IR大鼠體重并沒有如預(yù)期比正常普食組大鼠體重增加明顯，說明體重增加與胰島素抵抗并無必然聯(lián)系；電針治療2周后，控制飲食的EA2組大鼠體重比HFC組IR大鼠體重明顯減輕（P＜0.01），說明電針治療和（或）飲食控制對IR大鼠體重減輕有極為明顯的作用。血糖、胰島素及ISI結(jié)果顯示，胰島素抵抗大鼠體內(nèi)胰島素濃度明顯升高（P＜0.01），但血糖濃度并沒有顯著地降低，反而升高了，說明機體對胰島素的敏感性明顯降低了，而電針治療和（或）飲食控制對其有明顯的改善作用，特別是二者結(jié)合使用效果更佳。GLUT4mRNA的表達量結(jié)果顯示，IR后其表達量顯著降低（P＜0.01），造成葡萄糖轉(zhuǎn)運障礙，使血糖升高，而電針治療和（或）飲食控制對其表達量的影響十分明顯，從而有力地改善了骨骼肌葡萄糖的轉(zhuǎn)運，使血糖降低。GSK－3βmRNA的表達量結(jié)果顯示，IR后其表達量增加明顯（P＜0.01），從而對糖原合成酶的抑制作用就更加強烈，而電針治療和（或）飲食控制有極為顯著地改善作用，使糖原合成酶的抑制減少，糖原合成增加，血糖降低。

綜上所述，電針改善大鼠胰島素抵抗狀態(tài)可能是通過影響胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的GLUT4和GSK－3βmRNA的表達量，從而影響葡萄糖攝取、轉(zhuǎn)運和合成，進而改善高胰島素血癥、高血糖癥，提高胰島素敏感指數(shù)，改善胰島素抵抗狀態(tài)。

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