潘盛波，雷 浪，李厚軒，閆福華

2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院 附屬口腔醫(yī)院，南京 210008

牙周感染與動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）密切相關(guān)。流行病學(xué)研究和動物實驗均顯示，牙周感染能夠加速AS的形成[1－2]。牙周炎進(jìn)展過程中，細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物可以進(jìn)入血液，形成低水平的菌血癥和內(nèi)毒素血癥。在血管壁中，宿主防御系統(tǒng)可能利用 Toll樣受體（toll like receptors，TLRs）等模式識別受體，識別侵入的牙周致病菌及其代謝產(chǎn)物，激活多種促炎轉(zhuǎn)錄因子的激活，產(chǎn)生先天免疫反應(yīng)，導(dǎo)致組織局部炎癥反應(yīng)發(fā)生[3]。目前，AS被認(rèn)為是一種炎癥性疾病，AS血管局部腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factorα，TNF－α）、單核細(xì)胞趨化蛋白－1（monocyte chemotactic protein－1，MCP－1）、白細(xì)胞介素－1β（interleukin－1β，IL－1β）等炎癥因子表達(dá)上調(diào)，血管局部表現(xiàn)為炎癥反應(yīng)[4－5]。牙齦卟啉 單 胞 菌 （Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis）能夠刺激主動脈內(nèi)皮細(xì)胞、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞促炎細(xì)胞因子的表達(dá)[6]。載脂蛋白E基因敲除（apolipoprotein E－deficient，ApoE－／－）小鼠由于脂質(zhì)代謝障礙，在普通飲食下即可形成高脂血癥，是建立AS理想的動物模型[7]。本研究擬進(jìn)一步分析TLR通路在P.gingivalis菌血癥促進(jìn)ApoE－／－小鼠AS進(jìn)展過程中的作用，進(jìn)一步揭示牙周病和心血管疾病間的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料P.gingivalis33277（美國 ATCC公司）；腦心浸出液（brain heart infusion，BHI）、酵母提取物（英國Oxoid公司）；蘇丹Ⅳ染料（美國Sigma公司）；TNF－α、MCP－1和IL－1β酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（美國eBioscience公司）；TNF－α和 MCP－1多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；免疫組織化學(xué)試劑盒（中國邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；核因子－κB（nuclear factor－κB，NF－κB）、TLR－2、TLR－4 和GAPDH多克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、HRP標(biāo)記二抗、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（中國碧云天生物技術(shù)有限公司）；脫脂奶粉（美國BD公司）；凝膠電泳遷移率實驗（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）試劑盒、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、生物素3′末端DNA標(biāo)記試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)P.gingivalis在含 37g／L BHI、5g／L 酵 母 提 取 物、5mg／L 氯 化 血 紅 素 和0.2mg／L甲萘醌的培養(yǎng)基中厭氧條件下培養(yǎng)。

1.2.2 動物飼養(yǎng) 6周齡 ApoE－／－小鼠（18只）[北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物中心，許可證號SCXK（京）2011－0012]，在無特異致病菌、恒溫、恒濕、12h光照和12h黑暗以普通飼料飼養(yǎng)4周。至10周齡時，分為對照組（9只）和P.gingivalis感染組（9只）。對照組尾靜脈注射50μL的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）；P.gingivalis感染組尾靜脈注射50μL含107個P.gingivalis細(xì)菌的PBS，每周1次，共10周。

1.2.3 標(biāo)本收集 注射細(xì)菌第10周時，接種P.gingivalis后24h，小鼠禁食過夜，異氟烷吸入麻醉，眶后靜脈取血后，實施安樂死，解剖分離主動脈樹（從主動脈近心端到髂動脈），其中3只的主動脈樹用于主動脈樹蘇丹Ⅳ染色，其他6只的主動脈樹分3段分別用于免疫組織化學(xué)、免疫印跡、凝膠電泳遷移率實驗檢測。

1.2.4 主動脈樹蘇丹Ⅳ染色 小鼠主動脈樹縱向剖開，固定于橡膠板上，4%的多聚甲醛固定24h，70%乙醇漂洗5min，0.5%蘇丹Ⅳ（由35%乙醇和50%丙酮混合液配制）染色6min，80%乙醇脫染5min。數(shù)碼相機(jī)拍照，采用Image－Pro plus 6.0軟件測量分析。

1.2.5 血清炎癥因子檢測 血液標(biāo)本肝素抗凝，4℃、3 000r／min離心5min，收集上層血漿。按照ELISA試劑盒說明書的實驗操作步驟測定血液中TNF－α、MCP－1和IL－1β水平。

1.2.6 免疫組織化學(xué)染色 主動脈近心端1cm組織經(jīng)固定、脫水、浸蠟和包埋制作石蠟切片，5μm連續(xù)切片后，脫蠟、水化和抗原修復(fù)，3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，非免疫性動物血清封閉非特異性抗原，一抗TNF－α（1∶50）和 MCP－1（1∶50）4℃孵育過夜，加生物素化的二抗孵育，加SAB－HRP復(fù)合物，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，最后脫水、透明、封片并拍照，圖片采用Image－Pro plus 6.0軟件分析。

1.2.7 免疫印跡檢測 RIPA裂解液主動脈組織抽提蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度；聚丙烯酰胺凝膠電泳，每個上樣孔加40μg蛋白樣品，濃縮膠80V電泳20min，分離膠120V電泳60min；將電泳分離后的蛋白濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜到NC膜上；轉(zhuǎn)膜后，以5%脫脂奶粉封閉NC膜，加一抗TLR－2（1∶1000）、TLR－4（1∶1 000）和 GAPDH（1∶1 500）4℃ 孵育過夜，加 HRP標(biāo)記的二抗37℃孵育1h，用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，最后掃描分析條帶。

1.2.8 凝膠電泳遷移率檢測 抽提主動脈組織核蛋白并測定濃度；用生物素3′末端DNA標(biāo)記試劑盒將DNA探針標(biāo)記上生物素；樣品制備：樣品體系包括DNA探針、待測核蛋白、NF－κB抗體、反應(yīng)體系和上樣緩沖液的混合液；將樣品混合液加到上樣孔里，進(jìn)行非變性膠電泳；電泳后用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)膜后用紫外交聯(lián)儀進(jìn)行交聯(lián)；交聯(lián)后的膜在封閉液中封閉后，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素孵育，后加ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，掃描分析條帶。

2 結(jié) 果

2.1 斑塊面積變化 ApoE－／－小鼠主動脈樹蘇丹Ⅳ染色顯示，P.gingivalis感染組斑塊面積較對照組增加；量化分析顯示，P.gingivalis感染組斑塊面積百分比為（37.2±1.97）%，高于對照組（23.1±2.23）%（P＜0.05，圖1）。

圖1 主動脈粥樣斑塊形成Fig 1 Atherosclerotic plaque in aortic tree

2.2 血清炎癥因子水平的變化 ELISA法檢測血漿標(biāo)本炎癥因子水平，結(jié)果顯示：P.gingivalis感染組 TNF－α水平為（348.09±17.97）pg／mL，顯著高于對照組（202.46±16.62）pg／mL；P.gingivalis感染組 MCP－1水平為（755.34±41.53）pg／mL，明顯高于對照組（510.99±15.87）pg／mL；P.gingivalis感染組IL－1β水平為（126.65±27.45）pg／mL，顯著高于對照組（59.95±13.70）pg／mL（P＜0.05）（圖2）。

2.3 ApoE－／－小鼠主動脈組織炎癥因子水平 免疫組織化學(xué)染色主動脈組織切片顯示：P.gingivalis感染組主動脈血管壁TNF－α和 MCP－1均較對照組表達(dá)增加（圖3）。

圖2 血液炎癥因子水平Fig 2 Proinflammatory cytokines in blood

圖3 主動脈組織炎癥因子水平Fig 3 Expression of inflammatory cytokines in vascularwall

2.4 ApoE－／－小鼠主動脈組織 TLR－2、TLR－4蛋白表達(dá)水平和NF－κB活化水平 免疫印跡法檢測顯示：P.gingivalis感染組主動脈組織中TLR－2、TLR－4蛋白表達(dá)顯著高于對照組（P＜0.05，圖4A）。EMSA檢測主動脈組織中NF－κB的活化水平，結(jié)果顯示：P.gingivalis感染組明顯高于對照組（P＜0.05，圖4B）。

3 討 論

牙周感染與心血管疾病密切相關(guān)，能加速AS的形成。ApoE－／－小鼠靜脈注射P.gingivalis后，主動脈AS的形成加速[8]；同樣，高脂血癥小鼠口腔接種P.gingivalis后 ，無名動脈AS的形成加速[9]，提示牙周炎和牙周炎形成的菌血癥均會促進(jìn)AS進(jìn)展加速。然而，前述研究未深入研究牙周致病菌促進(jìn)AS的機(jī)制。本結(jié)果顯示，牙周致病菌通過TLRs／NF－κB通路，促進(jìn)全身的炎癥反應(yīng)，并且加重血管組織中的炎癥反應(yīng)，從而加速ApoE－／－小鼠AS的形成。

圖4 主動脈組織TLR－2和TLR－4蛋白表達(dá)水平和NF－κB活化水平Fig 4 Protein expression of TLR－2、TLR－4and NF－κB activity in in aortic tissues

在炎癥發(fā)生和進(jìn)展過程中，TNF－α、MCP－1和IL－1β等促炎細(xì)胞因子能夠活化和趨化免疫細(xì)胞，參與炎癥反應(yīng)。在人和動物的動脈粥樣斑塊中，均可觀察到這些炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的上調(diào)，說明其參與 AS形成[10－11]。本實驗觀察到，P.gingivalis感染組血液中 TNF－α、MCP－1和IL－1β水平較對照組增加，主動脈組織中TNF－α和 MCP－1表達(dá)上調(diào)。炎癥因子促進(jìn)AS形成的可能機(jī)制是 MCP－1能趨化血液中的單核細(xì)胞向血管壁遷移，并轉(zhuǎn)入內(nèi)膜下分化為巨噬細(xì)胞；TNF－α和IL－1β能夠活化內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)和 AS的形成[12]。

TLRs是一組病原體相關(guān)分子型識別受體，能識別細(xì)菌、病毒和寄生蟲等外界微生物的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜或者纖毛等的保守序列，即病原體相關(guān)性分子型（pathogen associated molecule patterns，PAMPs），在微生物感染反應(yīng)的固有免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。在肺炎支原體促進(jìn)AS的研究中，發(fā)現(xiàn)血管壁TLRs表達(dá)上調(diào)[13]。本實驗結(jié)果進(jìn)一步顯示，P.gingivalis感染組主動脈組織中 TLR－2和TLR－4蛋白表達(dá)增加，這與Gibson等的結(jié)果一致[14]；Liu等報道 TLR－2－／－ApoE－／－小鼠 AS明顯減少[15]。因此，推測P.gingivalis感染激活TLR－2和TLR－4的表達(dá)，通過級聯(lián)信號傳導(dǎo)，激活下游轉(zhuǎn)錄因子，激活細(xì)胞核內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄，引發(fā)機(jī)體固有免疫炎癥反應(yīng)，活化免疫細(xì)胞，加重AS。

NF－κB是主要的炎癥反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控許多細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子、急性反應(yīng)蛋白、生長因子等的表達(dá)。在人類AS病損的內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞中均能檢測到活化的NF－κB[16]，NF－κB參與 AS形成的各個階段。本實驗觀察到，P.gingivalis感染組主動脈組織中NF－κB活性增加，其可能機(jī)制是P.gingivalis依賴TLRs途徑，介導(dǎo)NF－κB的活化。

本實驗發(fā)現(xiàn)，血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等防御系統(tǒng)的成分利用P.gingivalis感染，通過TLR識別血液中的牙周致病菌P.gingivalis，激活將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)給NF－κB，使轉(zhuǎn)錄因子p65亞單位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與炎癥細(xì)胞因子基因中的轉(zhuǎn)錄序列結(jié)合，啟動多種炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。各種炎癥因子發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，活化、趨化免疫細(xì)胞，促進(jìn)血管局部和全身的免疫炎癥反應(yīng)，加速AS形成。

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