張照貴+李冰+王佳佳+張桂芝+李斯深

摘 要：SnRK2基因家族成員參與蛋白質(zhì)的磷酸化，在植物抵御非生物脅迫方面發(fā)揮重要的作用。本研究以水稻SAPK2基因序列為基礎(chǔ)，通過RT-PCR技術(shù)克隆得到一個(gè)新的小麥SnRK2基因，命名為TaSnRK2.2，并提交到GenBank（登錄號(hào)：KJ850253）。TaSnRK2.2基因全長4 118 bp，由9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子組成，包含一個(gè)1 026 bp的開放閱讀框，編碼341個(gè)氨基酸。SnRK2.2基因序列在禾本科植物中高度保守，TaSnRK2.2與水稻SAPK2以及玉米SnRK2.2親緣關(guān)系較近。TaSnRK2.2基因編碼的蛋白質(zhì)分子量為38.64 kD，理論等電點(diǎn)為5.45，含有SnRK2基因家族典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶保守結(jié)構(gòu)域和多處磷酸化位點(diǎn)。構(gòu)建了TaSnRK2.2基因過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得轉(zhuǎn)基因植株，通過RT-PCR方法檢測到TaSnRK2.2基因在擬南芥中穩(wěn)定表達(dá)。

關(guān)鍵詞：小麥；非生物脅迫；TaSnRK2.2；克隆；轉(zhuǎn)基因

中圖分類號(hào)：S512.1+Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2014）11-0001-07 小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物之一，全世界約有35%的人口以小麥為主食，在中國糧食消費(fèi)總量中，小麥占43%以上。我國地理環(huán)境復(fù)雜，自然災(zāi)害多發(fā)，干旱、鹽堿以及極端溫度等環(huán)境因素嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量，威脅小麥糧食生產(chǎn)安全。植物在長期的進(jìn)化過程中形成了一系列應(yīng)對復(fù)雜多變環(huán)境、抵御逆境脅迫的調(diào)控機(jī)制，眾多的調(diào)控和防御類基因構(gòu)成了植物應(yīng)答和抵御逆境脅迫的分子生物學(xué)基礎(chǔ)[1～3]。

研究表明，蔗糖非發(fā)酵相關(guān)蛋白激酶（Sucrose non-fermenting 1-related protein kinase， SnRK）參與蛋白質(zhì)的磷酸化，在植物激素信號(hào)傳導(dǎo)、抵御非生物脅迫和調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育等方面發(fā)揮重要的作用[4～6]。根據(jù)序列相似性和結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)，高等植物SnRK基因家族被分為3個(gè)亞族：SnRK1、SnRK2、SnRK3[7]。SnRK1基因已經(jīng)從不同的植物中分離和鑒定，其參與植物氮元素、蔗糖以及脂質(zhì)的代謝、器官發(fā)育與衰老等過程[8～11]。SnRK3基因又稱類鈣調(diào)磷酸酶B亞基互作蛋白激酶（calcineurin B-like protein interacting protein kinase， CIPK）基因[12，13]，能夠介導(dǎo)Ca2+信號(hào)的傳遞和提高植物的抗逆性[14～17]。SnRK2基因數(shù)目較少，編碼植物特有的蛋白激酶，主要參與植物應(yīng)對逆境脅迫、養(yǎng)分利用和生長發(fā)育等過程，到目前為止已經(jīng)鑒定了10個(gè)家族成員，統(tǒng)一命名為SnRK2.1～SnRK2.10[18]。

在小麥中，多個(gè)SnRK2基因家族成員已經(jīng)被克隆并進(jìn)行了功能驗(yàn)證。PKABA1是第一個(gè)被克隆的SnRK2家族成員，可被水分脅迫和脫落酸（Abscisic acid， ABA）誘導(dǎo)表達(dá)[19，20]。TaSnRK2.3可被聚乙二醇（Polyethylene glycol， PEG）、ABA、NaCl以及冷脅迫誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)TaSnRK2.3基因的擬南芥植株失水率下降，光合作用增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)脯氨酸含量增加，提高了對干旱、鹽漬以及冷害的耐受性[21]。轉(zhuǎn)TaSnRK2.4基因擬南芥植株較對照增加了對干旱、鹽分以及冷脅迫的抵抗能力，同時(shí)種子萌發(fā)延緩、初生根增長以及生物量增加，表明TaSnRK2.4在植物抗逆性和生長發(fā)育方面發(fā)揮作用[22]。轉(zhuǎn)TaSnRK2.7基因的擬南芥同樣增加了對多種逆境脅迫的抗性，但其活性不被ABA誘導(dǎo)，說明TaSnRK2.7參與非ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[23]。轉(zhuǎn)TaSnRK2.8基因的擬南芥除增強(qiáng)了對逆境抗性外，其可溶性糖含量降低，說明TaSnRK2.8在碳水化合物的代謝中發(fā)揮作用[24]。小麥W55a也屬于SnRK2家族成員，該基因受干旱等非生物脅迫的誘導(dǎo)[25]。以上研究表明，小麥SnRK2基因在抵御非生物脅迫方面發(fā)揮重要作用，并且參與植物的生長發(fā)育和碳水化合物的代謝過程。

隨著植物基因工程技術(shù)的發(fā)展，利用分子生物學(xué)方法克隆小麥抗逆相關(guān)基因，研究其生物學(xué)功能，探索植物抗旱分子機(jī)理是近來研究的熱點(diǎn)。水稻SAPK2基因是植物SnRK基因家族成員之一，本研究利用水稻SAPK2基因通過同源克隆的方法得到一個(gè)新的小麥SnRK2基因家族成員——TaSnRK2.2，并構(gòu)建該基因的植物過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，為進(jìn)一步研究該基因的功能及在逆境條件下的表達(dá)特征奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 小麥品種魯麥21用于TaSnRK2.2基因cDNA及gDNA的克隆和序列分析。Columbia型擬南芥用于遺傳轉(zhuǎn)化。

1.1.2 菌株和載體 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1和克隆載體pEASY-T1購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，農(nóng)桿菌菌株GV3101和表達(dá)載體PBI121由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 酶、試劑盒及其他耗材 LA Taq酶、限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶以及dNTP購自寶生物工程（大連）有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒The RevertAidTM Premium First Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas公司。RNA提取試劑TRIzol購自Invitrogen公司。普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。其它化學(xué)藥品為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 引物和測序 本試驗(yàn)所用PCR引物合成及DNA測序工作由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA、gDNA提取和第一鏈cDNA合成 小麥總RNA提取步驟按照TRIzol試劑說明書進(jìn)行。小麥gDNA的提取參照改良的CTAB法[26]進(jìn)行。第一鏈cDNA的合成參照The RevertAidTM Premium First Strand cDNA Synthesis Kit說明書進(jìn)行。

1.2.2 目的基因的克隆 以水稻SAPK2基因（GenBank登錄號(hào)：AB125303）的mRNA序列為探針?biāo)阉餍←淓ST數(shù)據(jù)庫，選取與探針序列相似性高的小麥EST，經(jīng)DNAMAN軟件拼接組裝成TaSnRK2.2的電子克隆序列。利用NCBI中ORF finder程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）進(jìn)行開放閱讀框（open reading frame， ORF）預(yù)測。用Primer Premier 5.0軟件在ORF兩側(cè)設(shè)計(jì)引物Sn1，上游引物Sn1-F：5′-ATGGAGCGGTACGAGGTG-3′；下游引物Sn1-R：5′-CACGCCTGCTCGTCACAA-3′

利用Sn1引物對小麥cDNA和gDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20 μL：10×PCR buffer 2 μL，dNTPs（各2.5 mmol/L）1.6 μL，LA Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，Sn1-F（10 μmol/L）和Sn1-R（10 μmol/L）各1 μL，cDNA或gDNA 1 μL（100 ng），ddH2O 13.2 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性35 s，56℃退火35 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。

PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段?；厥债a(chǎn)物與pEASY-T1載體于25℃連接15 min，并轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布在含100 mg/L氨芐青霉素（Ampicillin， Amp）的LB平板上，37℃條件下培養(yǎng)12～16 h。隨機(jī)挑選菌斑，在含有100 mg/L Amp的LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)4～5 h，取1 μL菌液進(jìn)行PCR檢測。挑選陽性克隆送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.3 基因的生物信息學(xué)分析 運(yùn)用DNAMAN軟件對測序結(jié)果進(jìn)行比對，確定基因結(jié)構(gòu)，并與其他物種的序列進(jìn)行相似性分析。利用ProtParam程序（http：//web.expasy.org/protparam/）分析氨基酸序列的理化性質(zhì)。利用NetPhos2.0 Server程序（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預(yù)測蛋白序列中的磷酸化位點(diǎn)。利用MEGA 6.0軟件進(jìn)行序列比對和進(jìn)化分析。功能區(qū)域和活性位點(diǎn)分析通過在線程序PROSITE（http：//expasy.hcuge.ch/sprot/prosite.html）進(jìn)行。利用SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和Swiss-Model 程序（http：//swissmodel.expasy.org/）對蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.2.4 表達(dá)載體的構(gòu)建和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 參照質(zhì)粒小提試劑盒說明書的步驟，提取pEASY-T1-TaSnRK2.2和PBI121質(zhì)粒。設(shè)計(jì)引物Sn2，上游引物Sn2-F：5′-TAGGATCCATGGAGCGGTACGAGGTG-3′（下劃線標(biāo)注的堿基代表BamH Ⅰ內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)）；下游引物Sn2-R：5′-AT-GAATTCCACGCCTGCTCGTCACAA-3′（下劃線標(biāo)注的堿基代表EcoRⅠ內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)）。利用Sn2引物對pEASY-T1-TaSnRK2.2質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物和PBI121質(zhì)粒用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，回收目的片段，用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的正義35S∶ TaSnRK2.2過表達(dá)載體。

將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，采用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌菌液加到含有50 mg/L 利福平（Rifampicin， Rif）和50 mg/L卡那霉素（Kanamycin， Kan）的YEP固體培養(yǎng)基上，在28℃條件下培養(yǎng)2～3天。轉(zhuǎn)化子長出后挑取單菌落于YEP液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測序驗(yàn)證。

1.2.5 擬南芥的侵染和轉(zhuǎn)基因植株的鑒定 將驗(yàn)證正確的農(nóng)桿菌接種于含有50 mg/L Rif的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)至菌液渾濁。按照1∶ 100的體積比將菌液轉(zhuǎn)接到50 mL含有50 mg/L Rif 的YEP液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.6。5 000 r/min離心10 min，倒掉上清液，用等體積含有5%蔗糖和0.02% Silwet L-77的侵染液重懸菌體，即可用于擬南芥的轉(zhuǎn)化。采用花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，侵染時(shí)將擬南芥平放，使花序浸到浸染液中約10 s左右，然后將擬南芥平放到培養(yǎng)箱中，黑暗培養(yǎng)24 h后正常培養(yǎng)。

將收獲的擬南芥種子在超凈臺(tái)中用70%乙醇滅菌5 min，2.6%次氯酸鈉消毒10 min，用滅菌水沖洗干凈。將滅菌的種子鋪到含有50 mg/L Kan的1/2 MS培養(yǎng)基上，4℃條件下春化2天。轉(zhuǎn)移到正常條件下培養(yǎng)7天后，轉(zhuǎn)化植株幼苗能夠在含有Kan的培養(yǎng)基上正常生長，葉片呈綠色，非轉(zhuǎn)化幼苗則會(huì)呈現(xiàn)黃化狀態(tài)。將轉(zhuǎn)基因幼苗移植到基質(zhì)中培養(yǎng)，植株長成后提取RNA進(jìn)行RT-PCR檢測，引物為Sn3，上游序列Sn3-F：5′-GCGAGAATGAGGCTAGGTTC-3′；下游序列Sn3-R：5′-CGTCGTCTATGTCGTCCAG-3′。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaSnRK2.2基因克隆

以水稻SAPK2基因?yàn)樘结樅Y選小麥EST數(shù)據(jù)庫，選取2條序列相似性高且相互重疊的EST片段，CJ785127和DR741853。利用DNAMAN軟件拼接，得到長度為1 359 bp的電子克隆序列，預(yù)測包含一個(gè)長度為1 026 bp的ORF。在ORF兩側(cè)設(shè)計(jì)引物Sn1對小麥cDNA和gDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后顯示大小約為1 000 bp和4 000 bp（圖1）。

測序結(jié)果表明，TaSnRK2.2基因的cDNA全長1 038 bp，包含長度為1 026 bp的ORF，編碼341個(gè)氨基酸，與預(yù)期結(jié)果基本一致。與cDNA相對應(yīng)的gDNA序列全長（從ATG到TGA）4 118 bp，包含9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子（圖2），基因結(jié)構(gòu)與水稻、玉米以及擬南芥的SnRK2.2相同，并且不同物種外顯子大小和序列保守性較內(nèi)含子強(qiáng)。序列已提交至GenBank（登錄號(hào)：KJ850253）。

2.2 TaSnRK2.2基因的生物信息學(xué)分析

TaSnRK2.2基因編碼的蛋白質(zhì)分子量為38.64 kD，理論等電點(diǎn)為5.45。PROSITE程序分析表明（圖3A），蛋白序列中含有絲氨酸/蘇氨酸基因家族典型的保守結(jié)構(gòu)域（第4～260位的氨基酸）、ATP結(jié)合位點(diǎn)（第10～33位的氨基酸）和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)（第119～131位的氨基酸）。NetPhos2.0 Server程序分析蛋白序列中含有7處絲氨酸（Serine， Ser）、1處蘇氨酸（Threonine， Thr）和5處酪氨酸（Tyrosine， Tyr）磷酸化位點(diǎn)（圖3C）。運(yùn)用SOPMA和Swiss-Model對TaSnRK2.2蛋白質(zhì)序列的高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，TaSnRK2.2基因編碼的蛋白質(zhì)含有38.12%的α螺旋、37.2%的無規(guī)則卷曲、8.21%的β轉(zhuǎn)角以及16.42%的擴(kuò)展鏈，具有和SnRK2基因家族類似的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖3B）。

TaSnRK2.2基因與水稻、玉米和擬南芥SnRK2.2基因核苷酸序列的相似性分別為87.23%、85.48%和60.24%，氨基酸序列的相似性分別為91.20%、89.44%和66.76%。將TaSnRK2.2與水稻、玉米、擬南芥SnRK2基因家族成員做聚類分析，結(jié)果表明，SnRK2基因分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三個(gè)亞族，TaSnRK2.2屬于Ⅱ亞族，與SAPK2和ZmSnRK2.2親緣關(guān)系較近（圖4）。

2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

用Sn2引物擴(kuò)增質(zhì)粒pEASY-T1-TaSnRK2.2，PCR產(chǎn)物與PBI121-GUS質(zhì)粒（約14.7 kb）同時(shí)進(jìn)行BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切（圖5）?；厥諑в忻盖形稽c(diǎn)的TaSnRK2.2片段（1 026 bp）和PBI121載體雙酶切片段（約12.7 kb），經(jīng)T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建由CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的、正義35S∶ TaSnRK2.2過表達(dá)載體（圖6）。將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，采用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101，酶切鑒定陽性克?。▓D7）。

2.4 擬南芥的轉(zhuǎn)化及RT-PCR檢測

采用花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，收獲T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子，經(jīng)適當(dāng)干燥并消毒后平鋪在含有Kan的1/2 MS培養(yǎng)基上。PBI121載體帶有Kan抗性基因，轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗在含有 Kan的培養(yǎng)基上生長正常，而非轉(zhuǎn)基因幼苗生長不正常，發(fā)生黃化（圖8）。利用RT-PCR檢測目標(biāo)基因在T1代轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)情況，結(jié)果如圖9，非轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中無TaSnRK2.2基因表達(dá)，而在轉(zhuǎn)基因植株中檢測到TaSnRK2.2基因的表達(dá)。

3 討論與結(jié)論

蛋白質(zhì)的可逆磷酸化由蛋白激酶和蛋白磷酸酶共同調(diào)控，廣泛參與植物對逆境脅迫和病蟲害刺激的應(yīng)答、植物體內(nèi)能量代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[27， 28]。大量的植物蛋白激酶已被分離和鑒定，許多蛋白激酶處于植物對逆境脅迫感知和響應(yīng)的中心環(huán)節(jié)[29]。植物SnRK2屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，各成員以不同的調(diào)控方式參與多種逆境脅迫應(yīng)答，在擬南芥、水稻、玉米、大豆、高粱、煙草等植物中已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究和報(bào)道[30～35]。在小麥中，克隆了6個(gè)SnRK2基因并進(jìn)行了功能分析，其在小麥抵御逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。

本研究通過同源克隆結(jié)合RT-PCR方法克隆得到一個(gè)新的小麥SnRK2基因——TaSnRK2.2。TaSnRK2.2基因由9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子組成，包含一個(gè)1 026 bp的ORF，編碼341個(gè)氨基酸。序列比對和進(jìn)化分析表明，SnRK2.2基因在禾本科植物中高度保守，TaSnRK2.2與水稻SAPK2以及玉米SnRK2.2親緣關(guān)系較近。SAPK2和ZmSnRK2.2受NaCl和高滲脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[29，36]，推測TaSnRK2.2可能具有相同的生物學(xué)功能。TaSnRK2.2編碼蛋白質(zhì)含有SnRK2基因家族典型的絲氨酸/蘇氨酸保守結(jié)構(gòu)域，具有ATP結(jié)合位點(diǎn)和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)，同時(shí)含有絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。由此推測，TaSnRK2.2基因可能參與蛋白質(zhì)的磷酸化，介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與小麥應(yīng)對滲透脅迫的反應(yīng)。

為了研究TaSnRK2.2基因在逆境脅迫中的作用，構(gòu)建了TaSnRK2.2基因的植物過表達(dá)載體，采用花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得了轉(zhuǎn)TaSnRK2.2基因的擬南芥植株。通過RT-PCR方法檢測到TaSnRK2.2基因在擬南芥中穩(wěn)定表達(dá)，為該基因進(jìn)一步的功能分析奠定了基礎(chǔ)，以期為小麥抗逆分子育種提供優(yōu)良的候選基因資源。

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