王立霞

（陜西學前師范學院，陜西 西安 710100）

環(huán)磷酸腺苷 （簡稱 cAMP，Adenosine 3′，5′-cyclic monophosphate）1957年由 Sutherland發(fā)現(xiàn)，它普遍存在于哺乳動物體內(nèi)，控制并調(diào)節(jié)細胞新陳代謝[1-3]。醫(yī)學研究證實，至少40多種疾病（癌癥、冠心病、心源性休克、高血壓和心肌梗死等重大疾?。┡ccAMP代謝有關(guān)，人體缺乏cAMP或cAMP/cGMP值下降，會導致眾多疾病的發(fā)生。cAMP是棗中重要活性物質(zhì)[4-5]。據(jù)報道，棗成熟果肉中cAMP含量為一般動植物的數(shù)千至數(shù)萬倍，具有重要開發(fā)價值[6-7]。目前，已有關(guān)于cAMP在保健食品領(lǐng)域應用的報道[8]。我國棗園面積已達150多萬公頃，產(chǎn)量200萬t，新疆和田地區(qū)憑借其獨特資源優(yōu)勢，近年棗業(yè)發(fā)展迅速，面積達30多萬公頃[9]。作者已對不同產(chǎn)地、不同含水量、不同組織駿棗、灰棗中cAMP含量進行了研究并得出結(jié)果，和田玉棗（山西省交城縣駿棗引種于和田后其商品名稱為和田玉棗）中cAMP含量相對最高。

微波輻射過程是高頻電磁波穿透萃取介質(zhì)，達到物料內(nèi)部維管束和腺胞系統(tǒng)，胞內(nèi)溫度迅速上升，細胞膨脹破裂，胞內(nèi)有效成分自由流出，在較低的溫度下提取介質(zhì)。利用微波可更快、更均衡地加熱材料，并且實現(xiàn)更高的產(chǎn)量和有更干凈的反應物。關(guān)于cAMP的提取方法，作者已對傳統(tǒng)溶劑提取法進行了研究，本研究中引入了微波輔助提取法，并對傳統(tǒng)溶劑提取法和微波輔助提取法進行對比，以獲取微波輔助提取和田玉棗cAMP的最優(yōu)工藝參數(shù)。本研究成果為和田玉棗及其它棗品種cAMP的深入研究及開發(fā)利用提供了參考及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新疆和田玉棗，2012年10月采摘后烘干棗，棗去核經(jīng)40℃干燥，粉碎過60目篩，室溫下密封保存；cAMP標品（純度≥99%），色譜純，德國Sigma公司生產(chǎn)；甲醇 （純度99.8%），色譜純，加拿大Promptar公司生產(chǎn)；其余試劑為國產(chǎn)分析純。LS-200型大孔吸附樹脂，西安藍深特種樹脂有限公司生產(chǎn)。

1525型高效液相色譜儀，Waters公司制造；TDL-5型低速大容量離心機，上海安亭科學儀器有限公司制造；UV2550型紫外可見分光光度計，Shimadzu公司制造；WD780BS微波爐，格蘭仕電器有限公司制造。

1.2 實驗方法

1.2.1 高效液相色譜檢測條件 色譜柱：Brava-BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱；流動相：甲醇-雙蒸水（pH 為 3）（體積比 10∶90）；體積流量 0.8 mL/min，紫外全波長掃描（如圖1所示）確定檢測波長257.0 nm，室溫，進樣量 20 μL[10-12]。

圖1 cAMP標準品掃描圖譜Fig.1 Scanning images of standard cAMP

1.2.2 cAMP標品溶液的制備及標準曲線的制作精密稱取cAMP標品2.5 mg，置50 mL容量瓶，加流動相至刻度，搖勻，得0.05 mg/L cAMP標品溶液。分別吸標品溶液 1、2、3、4、5、6、7、8 mL 于 10 mL 容量瓶，加流動相至刻度，搖勻，得 5、10、15、20、25、30、35、40 μg/mL 系列標品溶液，分別吸 20 μL 系列標品溶液入色譜儀[13-14]，記錄色譜圖，以濃度為橫坐標，以cAMP峰面積為縱坐標線性回歸，得線性方程

1.2.3 乙醇體積分數(shù)對棗cAMP提取量的影響實驗準確稱取和田玉棗粉2 g（按1.1中所介紹方法制得），以料液比1∶15[9]分別溶解于體積分數(shù)5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%的乙醇溶液，常溫浸泡8 h，300 W功率微波處理1 min，所得溶液離心、過濾、真空濃縮后用雙蒸水定容，過0.45 μm濾膜，進樣分析，保留時間法定性。如圖2所示，樣品峰與標品峰的保留時間幾乎一致，分別為8.253min和8.297 min，以后均按此法進行檢測[15-16]。峰面積外標法定量[8-9]，測不同體積分數(shù)乙醇中提取物的提取量（μg/g）。

圖2 樣品及標品中cAMP色譜圖Fig.2 Chromatogram of cAMP in jujube sample and standard cAMP

1.2.4 微波提取條件對棗cAMP提取量的影響實驗影響微波輔助提取效果的主要因素有微波功率、微波時間、浸泡時間及液料比，對上述4因素進行單因素實驗，并在此基礎(chǔ)上進行正交實驗，確定最佳提取工藝參數(shù)[17-21]。在進行微波輔助法提取的同時，與超聲波輔助法及傳統(tǒng)溶劑法進行對比。

1）微波功率對棗cAMP提取量的影響實驗：準確稱取和田玉棗粉2 g，以料液比1∶15加入體積分數(shù)10%乙醇溶液，常溫浸泡8 h，分別在100、200、300、400、500、600 W 功率下微波處理 1 min[22]。分別測定（方法見 1.2.3，下同）cAMP 提取量（μg/g），確定最佳提取功率。

2）微波時間對棗cAMP提取量的影響實驗：準確稱取和田玉棗粉2 g，以料液比1∶15加入體積分數(shù)10%乙醇溶液，常溫浸泡8 h，300 W功率分別微波處理 1、2、3、4、5、6 min[23]。分別測定 cAMP 提取量（μg/g），確定最佳提取時間。

3）浸泡時間對棗cAMP提取量的影響實驗：準確稱取和田玉棗粉2 g，以料液比1∶15加入體積分數(shù) 10%乙醇溶液， 分別常溫浸泡 0、2、4、6、8、10 h，300 W功率微波處理 3 min[24]。分別測定cAMP提取量（μg/g），確定最佳浸泡時間。

4）液料比對棗cAMP提取量的影響實驗：準確稱取和田玉棗粉 2 g， 分別以料液比 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 加入體積分數(shù) 10%乙醇溶液，常溫浸泡6 h，以300 W功率微波處理3 min。分別測定cAMP提取量（μg/g），確定最佳料液比。

5）正交實驗：在單因素實驗基礎(chǔ)上對微波功率、微波時間、浸泡時間、料液比采用L9（34）正交實驗進行優(yōu)選，以確定最佳微波工藝。因素水平設計見表1[25]。

表 1 L9（34）實驗因素水平表Table 1 L9（34） Orthogonal factor level table

1.2.5 和田玉棗cAMP的分離效果實驗 用LS-200型大孔吸附樹脂做動態(tài)吸附及解吸實驗[11]，計算和田玉棗cAMP的分離效率。

1）泄露曲線的研究試驗：準確稱取25 mL處理好的LS-200型樹脂裝玻璃層析柱，將和田玉棗粉以1∶15料液比加入體積分數(shù)10%乙醇溶液，按照2.2.5中最優(yōu)條件提取cAMP，過濾后真空濃縮，調(diào)整質(zhì)量濃度為30 μg/mL，pH為4，進行動態(tài)吸附[11]：上樣體積流量1 mL/min，其間每管收集20 mL，過0.45 μm濾膜，進樣分析，測流出液濃度，至流出液濃度與上樣液濃度相同時停止上樣，做泄露曲線，確定最佳上樣體積。

2）LS-200型樹脂的洗脫曲線：準確稱取25 mL處理好的LS-200型樹脂裝玻璃層析柱，量取160 mL和田玉棗cAMP上樣液，調(diào)整質(zhì)量濃度為30 μg/mL，pH為4，以1 mL/min體積流量上柱吸附。先用蒸餾水洗脫，每50 mL收集一份，再用體積分數(shù)35%乙醇洗脫，每20 mL收集一份，分別將洗脫液于50℃下真空濃縮除去溶劑，用蒸餾水定容于25 mL容量瓶中，過0.45 μm濾膜，進樣分析，計算其cAMP含量，做洗脫曲線，并將洗脫液真空濃縮后冷凍干燥，測定其純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇體積分數(shù)對棗cAMP提取量的影響

乙醇體積分數(shù)對棗cAMP提取量的影響見圖3?？梢?，隨著乙醇體積分數(shù)增大，cAMP提取量先增大后緩慢減小。在乙醇體積分數(shù)為15%時，cAMP提取量達到最高，為570.33 μg/g，僅比乙醇體積分數(shù)10%時高1 μg/g，考慮能量節(jié)省及減少污染等因素，乙醇體積分數(shù)以10%為宜。

圖3 乙醇體積分數(shù)對cAMP提取量的影響Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on extracting content of cAMP

2.2 微波提取條件對棗cAMP提取量的影響

2.2.1 微波功率對棗cAMP提取量的影響 微波功率對棗cAMP提取量的影響見圖4。由圖可見，cAMP提取量隨微波功率的增大而先增大后緩慢減小，當微波功率為300 W時，cAMP提取量最高為571.23 μg/g，故選擇微波提取功率300 W為宜。

圖4 微波功率對cAMP提取量的影響Fig.4 Effect of power of microwave wave on extracting content of cAMP

2.2.2 微波時間對棗cAMP提取量的影響 提取時間對棗cAMP提取量的影響見圖5。由圖可見，cAMP提取量隨微波時間的延長而先增大后緩慢減小，當微波時間為3 min時，cAMP提取量最高為590.89 μg/g，故選擇微波提取時間3 min為宜。

2.2.3 浸泡時間對棗cAMP提取量的影響 浸泡時間對棗cAMP提取量的影響見圖6?？梢?，cAMP提取量隨浸泡時間的延長而先增大后減小，這是由于適當浸泡可促進細胞中cAMP的溶出，但浸泡時間過長，cAMP又發(fā)生改變，當浸泡時間為6 h時，cAMP提取量最高為621.35 μg/g，故選擇浸泡時間6 h為宜。

圖5 微波時間對cAMP提取量的影響Fig.5 Effect of microwave time on extracting content of cAMP

圖6 浸泡時間對cAMP提取量的影響Fig.6 Effect of soak period on extracting content of cAMP

2.2.4 料液比對棗cAMP提取量的影響 料液比對棗cAMP提取量的影響見圖7。可見，cAMP提取量隨料液比的增大而先增大后趨于一致，當料液比為 1∶25 時，cAMP 提取量最高為 651.65 μg/g， 故選擇料液比1∶25為宜。

圖7 料液比對cAMP提取量的影響Fig.7 Effect of liquid-solid ratio on extracting content of cAMP

2.2.5 正交實驗 按L9（34）進行正交實驗，數(shù)據(jù)處理及結(jié)果見表2，方差分析見表3。由極差分析可知，各因素對cAMP提取量影響的大小順序為：微波時間＞微波功率＞料液比＞浸泡時間。微波輔助提取和田玉棗cAMP最優(yōu)工藝組合為A2B2C2D3，即微波功率300 W、微波時間3 min、浸泡時間6 h、料液比1∶30。由表3方差分析知，微波功率、微波時間、浸泡時間、料液比差異顯著。

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 Result of orthogonal experiment

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis table

2.2.6 驗證實驗 正交實驗中提取量最高的組合為A2B2C3D1，正交表分析得出最佳組合為A2B2C2D3，對兩組工藝進行驗證實驗，分別重復3次，取平均值。結(jié)果表明，最優(yōu)組合A2B2C2D3的cAMP提取量為 795.63 μg/g，組合 A2B2C3D1提取量為723.59 μg/g，因此微波輔助提取和田玉棗cAMP最優(yōu)工藝條件為微波功率300 W、微波時間3 min、浸泡時間6 h、料液比 1∶30。

2.3 提取方法比較

采用傳統(tǒng)溶劑法[9]、超聲波輔助法[11]提取和田玉棗cAMP，并與2.2.5中微波輔助法最優(yōu)工藝進行對比。3種方法工藝條件及實驗結(jié)果見表4。可見，微波輔助法（提取量795.63 μg/g）明顯優(yōu)于傳統(tǒng)溶劑法（620.28 μg/g），優(yōu)于超聲波輔助法（771.95 μg/g）。由于微波功率及微波時間短，故能耗少于超聲波輔助法。

表4 3種提取方法比較Table 4 Comparison of different extraction methods

2.4 和田玉棗cAMP分離純化效果

2.4.1 泄露曲線 LS-200型樹脂對和田玉棗cAMP的泄露曲線見圖8?？梢?，上樣160 mL，即第8份收集液以后流出液中cAMP含量開始升高，故將其確定為漏點。確定LS-200型樹脂最大上樣體積160 mL，即6.4倍樹脂體積。

圖8 LS-200型樹脂對和田玉棗cAMP的泄露曲線Fig.8 Leak curve of LS-200 resint adsorb cAMP from Hetianyuzao

2.4.2 LS-200型樹脂洗脫曲線 LS-200型樹脂洗脫曲線見圖9?？梢姡催^程中極少量cAMP洗脫下來，不影響cAMP得率。同時，HPLC色譜圖中發(fā)現(xiàn)大量雜質(zhì)被洗脫下來，第4份水洗物中吸收峰已很少，故確定脫除雜質(zhì)水洗體積200 mL（8倍樹脂體積）。35%乙醇洗脫第一份時，即有cAMP檢出，收集至第6份時，洗脫液幾乎不含cAMP，故確定體積分數(shù)35%乙醇洗脫劑為120 mL，即4.8倍樹脂體積。

圖9 洗脫曲線Fig.9 Washing curve

經(jīng)計算和田玉棗cAMP分離效率為97.81%。洗脫過程發(fā)現(xiàn)，顏色最重流份中cAMP含量最高，沒有顏色流份中幾乎不含cAMP，說明cAMP和色素結(jié)合在一起，故得到cAMP粗品純度不高，為3.47%。粗品色譜圖見圖10

圖10 和田玉棗cAMP粗品色譜圖Fig.10 Chromatogram of cAMP in Hetianyuzao crude sample

3 結(jié)語

經(jīng)單因素及正交實驗分析，確定微波輔助提取和田玉棗cAMP的最優(yōu)工藝條件：乙醇體積分數(shù)10%，微波功率300 W，微波時間3 min，浸泡時間6 h，料液比1∶30。在此工藝條件下，和田玉棗cAMP平均提取量為795.63 μg/g；影響和田玉棗cAMP提取量的各因素顯著順序為：微波時間＞微波功率＞料液比＞浸泡時間。

通過對3種提取方法的比較，得知微波輔助法較傳統(tǒng)溶劑法提取量高，提取時間短；較超聲波輔助法提取量高，能耗低。

采用LS-200型樹脂分離純化和田玉棗cAMP的分離效率為97.81%。cAMP粗品純度為3.47%。

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