張 樂(lè)， 劉 龍*， 李江華， 堵國(guó)成， 陳 堅(jiān)

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122；2.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

丁二酸，又稱(chēng)琥珀酸，是一種重要的化工中間體原料，廣泛存在于人體、動(dòng)植物和微生物中，應(yīng)用于醫(yī)藥、食品添加劑、綠色溶劑和表面活性劑等領(lǐng)域[1]。傳統(tǒng)工業(yè)中主要是利用石油基產(chǎn)品為原料通過(guò)化學(xué)合成的方法生產(chǎn)丁二酸，但這種方法具有高價(jià)格和高污染等局限性[2]。利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酸因具有可再生、環(huán)境友好、價(jià)格低廉等特性，逐漸成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，生物基丁二酸在石油基大宗化學(xué)產(chǎn)品市場(chǎng)中也越來(lái)越受到關(guān)注[3-4]。此外，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酸因具有發(fā)酵過(guò)程中利用CO2、能夠緩解溫室效應(yīng)這一優(yōu)點(diǎn)，被看做是一種非常綠色的工業(yè)技術(shù)[5]。

酵母膏是一種營(yíng)養(yǎng)成分豐富、產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定并廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)的氮源原料。相對(duì)其他氮源，酵母膏價(jià)格較高，增加了丁二酸生產(chǎn)的成本。玉米漿是玉米淀粉生產(chǎn)過(guò)程中得到的副產(chǎn)物，富含糖類(lèi)、可溶性蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽、脂肪酸、維生素、肌醇、水解酶，以及其他有機(jī)化合物、重金屬和無(wú)機(jī)離子[6-7]。玉米漿是生產(chǎn)抗生素、有機(jī)酸和其他發(fā)酵產(chǎn)品的培養(yǎng)基組成成分之一，由于其富含可溶性蛋白質(zhì)和多種游離氨基酸，是微生物發(fā)酵的良好氮源[8-9]，且價(jià)格低廉，有利于降低丁二酸生產(chǎn)成本，作為廉價(jià)替代氮源，具有重要的研究意義。

作者所在研究室利用法國(guó)羅蓋特公司提供的4種不同型號(hào)的玉米漿和一種國(guó)產(chǎn)玉米漿，研究在琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenes NJ113發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的過(guò)程中玉米漿可否替代酵母膏作為廉價(jià)氮源，并研究玉米漿中的關(guān)鍵組分（氨基酸、維生素和金屬元素）對(duì)丁二酸發(fā)酵的影響，以進(jìn)一步降低丁二酸生產(chǎn)的成本，并提高利用玉米漿作為氮源時(shí)丁二酸的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 生產(chǎn)菌株

Actinobacillus succinogenes NJ113，由南京工業(yè)大學(xué)制藥與生命科學(xué)學(xué)院材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選并保存。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 種子培養(yǎng)基質(zhì)量濃度 （g/L） 葡萄糖 10，酵母粉 5，NaH2PO49.6，K2HPO415.5，NaHCO310，玉米漿 2.5，NaCl 1。

1.2.2 原始發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量濃度 （g/L） 葡萄糖50，NaH2PO41.6， Na2HPO40.31， KH2PO43， NaAC 1.36，NaCl 1，CaCl20.2，MgCl2·6H2O 0.2， 酵 母 膏 5，（MgCO3）4Mg（OH）2·5H2O 50，玉米漿 5。

1.2 培養(yǎng)方法

將凍存于-70℃冰箱的菌種接種于種子培養(yǎng)基中，并在厭氧發(fā)酵瓶中通入CO22 min，擰緊瓶塞。220 r/min，37℃培養(yǎng)12 h作為種子液。將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為體積分?jǐn)?shù)5%，并在厭氧發(fā)酵瓶中通入CO22 min，擰緊瓶塞。220 r/min，37℃培養(yǎng)24 h。

1.3 分析方法

采用生物傳感分析儀（SBA240C，山東省科學(xué)院生物研究所提供）測(cè)定葡萄糖含量。發(fā)酵液中丁二酸含量測(cè)定采用高效液相色譜法[10]。采用UV mini-1240型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（島津公司制）于660 nm處測(cè)定OD值。

天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、組氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸、脯氨酸16種氨基酸含量均以高效液相色譜法測(cè)定[11]。

VB1、VB2、VC、 煙酸、VB6、VB12和生物素均以高效液相色譜法測(cè)定[12]。

錳（Mn）和銅（Cu）以石墨原子吸收光譜法測(cè)定[13-14]；鋅（Zn）、 鐵（Fe）、 鎂（Mg），以火焰原子吸收光譜法測(cè)定[15-16]；鉀（K）和鈉（Na）以火焰原子發(fā)射光譜法測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米漿替代酵母膏的初步研究

為初步研究玉米漿替代酵母膏作為氮源的可行性，首先在原始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，研究不同氮源組合對(duì)丁二酸發(fā)酵的影響，分別在發(fā)酵培養(yǎng)基中采用不同型號(hào)玉米漿與酵母膏的組合作為氮源，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，在總質(zhì)量濃度相同的情況下，不同型號(hào)玉米漿和酵母膏的組合作為氮源與僅用酵母膏作為氮源時(shí)相比，丁二酸產(chǎn)量和OD值有所不同：添加國(guó)產(chǎn)玉米漿后丁二酸產(chǎn)量和OD值降低較多；但添加095E、048K和No.120924玉米漿后二者降低較少；而添加095K玉米漿后丁二酸產(chǎn)量有所升高。初步判定玉米漿替代酵母膏作為氮源是可行的。但考慮到原始發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米漿質(zhì)量濃度較低，需進(jìn)一步優(yōu)化玉米漿的最適質(zhì)量濃度，在最適玉米漿質(zhì)量濃度的基礎(chǔ)上研究玉米漿替代酵母膏的可行性。

表1 不同氮源組合對(duì)丁二酸發(fā)酵的影響Table 1 Effect of different nitrogen source combinations on succinic acid fermentation

2.2 玉米漿型號(hào)和質(zhì)量濃度對(duì)丁二酸發(fā)酵的影響

對(duì)5種型號(hào)玉米漿設(shè)置6個(gè)質(zhì)量濃度水平（10、20、30、40、50、60 g/L）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究不同型號(hào)玉米漿的最適質(zhì)量濃度，結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 5種型號(hào)玉米漿不同質(zhì)量濃度水平的丁二酸產(chǎn)量Fig.1 Effect of batches and concentration of five corn steep liquor on the succinic acid yield of

圖2 5種型號(hào)玉米漿不同質(zhì)量濃度水平的OD值Fig.2 Effect of batches and concentration of five corn steep liquor on OD

由圖1圖2可知，分別單獨(dú)使用5種型號(hào)的玉米漿作為氮源時(shí)，丁二酸產(chǎn)量和OD值如表2所示。

表2 不同型號(hào)玉米漿的最適質(zhì)量濃度及相應(yīng)丁二酸產(chǎn)量和OD值Table 2 Optimal concentration of five batches of corn steep liquor and the corresponding yield of succinic acid and OD

由表2可知，5種型號(hào)玉米漿的最適質(zhì)量濃度均為40 g/L，當(dāng)采用玉米漿095K和No.120924時(shí)，丁二酸產(chǎn)量較高，分別為29.4 g/L和24.3 g/L，故選擇此兩種型號(hào)玉米漿進(jìn)行進(jìn)一步替代實(shí)驗(yàn)。

2.3 玉米漿替代酵母膏作為氮源的最適比例

基于以上研究，選擇095K和No.120924玉米漿進(jìn)一步研究玉米漿可否替代酵母膏作為廉價(jià)氮源以及最適替代比例，因兩種型號(hào)的玉米漿的最適質(zhì)量濃度均為40 g/L，故比較質(zhì)量濃度為40 g/L的玉米漿、酵母粉和不同比例的二者混合物作為氮源時(shí)丁二酸的產(chǎn)量和OD值。其中玉米漿替代酵母膏的比例（體積分?jǐn)?shù)）分別為 0，20%，40%，60%，80%，100%。結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。

圖3 玉米漿095K替代不同比例酵母膏作為氮源時(shí)丁二酸的產(chǎn)量和OD值Fig.3 Yield of succinic acid and OD ofdifferent replacement ratios of 095K

由圖3可知，095K玉米漿代替不同比例的酵母膏作為氮源時(shí)，丁二酸產(chǎn)量和OD值相差很小，替代比例（體積分?jǐn)?shù)）可以達(dá)到100%，故可以用095K玉米漿完全替代酵母膏作為廉價(jià)氮源。

圖4 玉米漿NO.120924替代不同比例酵母膏作為氮源時(shí)丁二酸的產(chǎn)量和OD值Fig.4 Yield of succinic acid and OD ofdifferent replacement ratios of NO.120924

由圖4可知，當(dāng)No.120924玉米漿替代酵母膏的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%時(shí)，丁二酸產(chǎn)量下降7.6%，為26.43 g/L。當(dāng)替代體積分?jǐn)?shù)為100%時(shí)，丁二酸產(chǎn)量下降15.6%，為24.16 g/L?？芍?，No.120924玉米漿無(wú)法完全替代酵母膏，最高替代體積分?jǐn)?shù)為60%～80%。

2.4 玉米漿中關(guān)鍵組分對(duì)丁二酸發(fā)酵的影響

玉米漿中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分并對(duì)丁二酸發(fā)酵具有較大影響，為進(jìn)一步研究玉米漿影響丁二酸發(fā)酵的機(jī)理，充分發(fā)揮玉米漿作為廉價(jià)氮源的替代價(jià)值，將深入研究玉米漿中關(guān)鍵組分對(duì)丁二酸發(fā)酵的影響。測(cè)定095K玉米漿中各種氨基酸、維生素和金屬離子的含量，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)初步研究各組分對(duì)丁二酸發(fā)酵的影響，選擇對(duì)丁二酸發(fā)酵影響較大的組分進(jìn)行正交試驗(yàn)，得到各關(guān)鍵組分的優(yōu)化組合并驗(yàn)證，以期提高丁二酸產(chǎn)量。

2.4.1 玉米漿主要成分檢測(cè) 玉米漿095K中各種組分的含量見(jiàn)表3。

2.4.2 玉米漿中各種成分對(duì)丁二酸產(chǎn)量的影響基于以上研究，利用16種氨基酸，4種金屬離子（Zn、Fe、Cu、Mn），6 種 維 生 素 （VB1，VB2，VB6，VB12，煙酸，生物素）配制的合成氮源替代玉米漿，各組分的初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)相當(dāng)于其在含有40 g/L 095K玉米漿的培養(yǎng)基中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。以該合成氮源作為對(duì)照組，通過(guò)單因素缺失法初步研究各組分對(duì)丁二酸發(fā)酵的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4單因素實(shí)驗(yàn)可知，對(duì)丁二酸產(chǎn)量影響最大的為谷氨酸、蘇氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、煙酸和生物素6種組分，故選用這6種組分進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

表3 玉米漿中氨基酸、維生素和金屬離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 3 Contents of ingredients of corn steep liquor 095K

表4 氨基酸、維生素及金屬離子對(duì)丁二酸發(fā)酵的影響Table 4 Effect of the ingredients on the yield of succinic acid

2.4.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析 根據(jù)表4中單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用正交試驗(yàn)考察谷氨酸、蘇氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、煙酸和生物素6種組分在丁二酸發(fā)酵中的重要作用及其相關(guān)關(guān)系。按照L25（56）正交試驗(yàn)因素水平表（表5）安排正交試驗(yàn)，其中6種組分的質(zhì)量濃度范圍根據(jù)不同質(zhì)量濃度梯度試驗(yàn)來(lái)確定，其他組分的質(zhì)量濃度不變。具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析見(jiàn)表6—8及圖5。

表5 正交試驗(yàn)因素水平表Table 5 Factors level table of orthogonal test

表6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 6 Orthogonal test design

表7 正交試驗(yàn)丁二酸產(chǎn)量的極差分析Table 7 Range analysis of yield of succinic acid

圖5 正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析Fig.5 Intuitive analysis of orthogonal test results

通過(guò)對(duì)以上正交試驗(yàn)結(jié)果的分析可以看出，在所選擇的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)：1）谷氨酸、生物素和煙酸是影響丁二酸生產(chǎn)的最重要因素；2）生物素、煙酸、谷氨酸和蘇氨酸是影響細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素；3）對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，得到了以丁二酸高產(chǎn)量為目標(biāo)的6種組分質(zhì)量濃度優(yōu)化組合，如表9所示。

表9 由正交試驗(yàn)得到的各組分質(zhì)量濃度優(yōu)化組合Table 9 Optimal combination of six kinds of ingredients

對(duì)表9所示的6種組分質(zhì)量濃度優(yōu)化組合進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。得到丁二酸產(chǎn)量和OD值分別為11.12 g/L和4.95，其中丁二酸產(chǎn)量與對(duì)照組（7.83 g/L）相比增加了41.8%。按照該質(zhì)量濃度優(yōu)化組合，向40 g/L 095K玉米漿中補(bǔ)充添加6種關(guān)鍵組分，以使用40 g/L 095K玉米漿為氮源作為對(duì)照組進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果表明，補(bǔ)充添加6種關(guān)鍵組分后，丁二酸產(chǎn)量和OD值可達(dá)到32.56 g/L和11.17，其中丁二酸產(chǎn)量與對(duì)照組（28.65 g/L）相比增加了14.7%。

3 結(jié)語(yǔ)

研究了在丁二酸發(fā)酵中不同型號(hào)玉米漿對(duì)丁二酸發(fā)酵的影響、玉米漿替代酵母膏作為廉價(jià)氮源以及玉米漿中關(guān)鍵組分對(duì)丁二酸發(fā)酵的影響，結(jié)果如下：

1）采用不同型號(hào)玉米漿作為氮源，丁二酸產(chǎn)量有較大差別，其中采用095K玉米漿時(shí)丁二酸產(chǎn)量最高，為 29.4 g/L，其次為No.120924、048K和095E，采用國(guó)產(chǎn)玉米漿丁二酸產(chǎn)量最低，為18.3 g/L。

2）采用095K玉米漿和No.120924研究了玉米漿替代酵母膏作為廉價(jià)氮源的可行性。結(jié)果表明，095K玉米漿可以完全替代酵母膏作為廉價(jià)氮源，而No.120924的最適替代體積分?jǐn)?shù)為60%～80%。表明替代酵母膏作為廉價(jià)氮源是可行的，有利于降低丁二酸生產(chǎn)成本。

3）測(cè)定095K玉米漿中氨基酸、維生素和金屬離子的含量，并通過(guò)正交試驗(yàn)研究了玉米漿中谷氨酸、蘇氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、煙酸和生物素6種組分對(duì)丁二酸發(fā)酵的影響，得到了6中關(guān)鍵組分的最適質(zhì)量濃度組合，通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，與對(duì)照組相比，丁二酸產(chǎn)量提高了41.8%。向40 g/L 095K玉米漿中補(bǔ)充添加6種關(guān)鍵組分后，與使用40 g/L 095K玉米漿為氮源相比，丁二酸產(chǎn)量增加了14.7%。通過(guò)研究玉米漿中關(guān)鍵組分對(duì)丁二酸產(chǎn)量的影響以及最適質(zhì)量濃度組合，對(duì)于提高玉米漿產(chǎn)品質(zhì)量具有一定指導(dǎo)意義，有利于進(jìn)一步提高丁二酸產(chǎn)量。

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