，， (南華大學附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，湖南 衡陽 421001)

維拉帕米阻抑UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化

萬青松，謝紅萍，楊波
(南華大學附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，湖南 衡陽 421001)

目的探討維拉帕米對單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響。方法將24只大鼠隨機分為對照組(即假手術(shù)組)、UUO模型組、維拉帕米治療組，采用單側(cè)輸尿管梗阻模型，術(shù)后8天觀察梗阻腎組織病理改變，比色法測定腎組織羥脯氨酸(HYP)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量,并應用放射免疫法檢測血漿和腎組織內(nèi)皮素-1(ET-1)的含量。結(jié)果與對照組比較，模型組腎組織HYP和MDA含量明顯升高，血漿和腎組織內(nèi)皮素-1含量明顯升高，腎組織SOD含量顯著下降(P<0.01),維拉帕米治療組與模型組相比，腎組織HYP和MDA含量明顯下降，血漿和腎組織內(nèi)皮素-1下降，腎組織SOD含量顯著升高，差異均有顯著性(P<0.05)。結(jié)論維拉帕米能減少單側(cè)輸尿管梗阻大鼠脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，降低血漿和腎組織內(nèi)皮素-1的含量，增加抗氧化酶的含量，從而阻抑UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化。

腎間質(zhì)纖維化； 氧化應激； 內(nèi)皮素-1； 維拉帕米

幾乎所有慢性進行性腎臟疾病都是纖維化破壞過程的結(jié)果，由于腎間質(zhì)纖維化的程度與腎功能受損的程度密切相關(guān)，單側(cè)輸尿管梗阻(unilateal ureteral obstruction,UUO)是研究腎間質(zhì)纖維化的經(jīng)典模型[1]。研究表明氧化應激參與腎間質(zhì)纖維化的形成[2]。維拉帕米可通過舒張血管平滑肌，改善腎臟灌注，抑制黃嘌呤脫氫酶向黃嘌呤氧化酶轉(zhuǎn)化而具有抗氧化應激作用[3]，在醫(yī)學研究中，維拉帕米對于順帕誘導的腎毒性有保護作用[4]，在臨床腎移植實踐中，維拉帕米可拮抗免疫抑制劑的腎毒性，因此，探討維拉帕米對腎間質(zhì)纖維化的影響，對于延緩慢性腎功能衰竭的進程具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SD大鼠(南華大學動物實驗中心提供)24只，雌性，體重210±30 g，隨機分為3組：對照組、模型組、維拉帕米治療組，每組大鼠為8只。

1.2 主要試劑及藥物

維拉帕米(也稱異博定)，哈藥集團制藥四廠生產(chǎn)，批號：H23020197。組織羥脯氨酸(Hydoxyl puamino acid，HYP)、丙二醛(Malondiadehyde，MDA) 、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)購于南京建成生物工程研究所。內(nèi)皮素-1(Endothelin-1，ET-1)放射免疫測試盒購自北京北免東雅生物技術(shù)研究所。

1.3 UUO模型建立

在無菌條件下將24只大鼠腹腔注射氯氨酮(50 mg/kg)，背部腎區(qū)開腹后結(jié)扎左側(cè)腎下極輸尿管，縫合腹腔，即制備UUO模型，對照組不結(jié)扎輸尿管，其余操作同上。術(shù)前24 h、術(shù)后每日、維拉帕米組予維拉帕米(每天0.5 mg/kg)混懸液2 mL灌胃，對照組、手術(shù)組予2 mL生理鹽水灌胃。術(shù)后第8天，每組處死8只大鼠取左側(cè)腎臟。

1.4 腎組織病理檢查

腎組織縱切，一部分用于放免測ET-1，另一部分10%中性甲醛固定，經(jīng)梯度酒精脫水、石蠟包埋，組織切片4 μm，作HE、Masson染色。

1.5 腎組織羥脯氨酸(HYP)含量測定

精確稱取腎組織濕重100 mg放入試管中，按照試劑盒說明操作，用721分光廣度計，在波長為550 nm光波下比色，測定前制備羥脯氨酸標準液及空白對照。

1.6 MDA、SOD測定

用預冷的0.85%生理鹽水裂解腎組織，制成10%和1%勻漿，比色法分別測定腎組織MDA含量及總SOD活性，按試劑盒說明書操作。

1.7 血漿、腎組織ET-1放免測定

取出活腎組織，吸去血跡稱取100 mg，盡快放入1 mol/L醋酸1 mL略做碾磨，然后在100 ℃水浴中煮沸10 min，勻漿。4 ℃ 3 000 rpm離心15 min，取上清液0.5 mL，-20 ℃以下保存，測定時用PBS五倍稀釋。取靜脈血1 mL，注入含10%EDTA二鈉3 μL和抑肽酶40 μL的試管中，混勻，4 ℃ 3 000 rpm離心10 min，分離血漿，取上清液0.5 mL，-20 ℃以下保存，測定前，使樣本在室溫中復融，再次4 ℃ 3 000 rpm離心5 min，取上清0.2 mL。用放射免疫平衡法檢測上述上清液ET-1含量。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 一般形態(tài)學改變

HE染色和Masson染色結(jié)果：模型組病理片表現(xiàn)腎小管上皮萎縮，腎小管腔擴張，間質(zhì)炎癥細胞浸潤，成纖維細胞增生，間質(zhì)纖維化，維拉帕米治療組也有以上表現(xiàn)，但炎癥細胞、成纖維細胞數(shù)量較模型組少。對照組腎臟膠原染色主要位于腎小管肌膜、腎小囊、系膜區(qū)和腎小管間的毛細血管周圍，腎小管間質(zhì)染色較少，而模型組腎小管間質(zhì)染色較對照組明顯增強，維拉帕米治療組腎小管間質(zhì)染色較對照組增強，但較模型組明顯降低(圖1)。

圖1 各組HE染色及Masson染色(×200)

2.2 3組羥脯氨酸、MDA和SOD含量比較

與對照組大鼠腎組織HYP含量(0.39±0.14 μg/mg)比較，模型組大鼠腎組織HYP含量(0.69±0.17 μg/mg)顯著升高(P<0.01),維拉帕米治療組大鼠腎組織HYP含量(0.47±0.13 μg/mg)較模型組明顯降低(P<0.05)。與對照組比較，模型組腎組織MDA含量顯著升高(P<0.01)，而抗氧化酶SOD含量顯著下降(P<0.01)。與模型組比較，維拉帕米治療組MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD含量顯著升高。見表1。

表1各組大鼠腎組織HYP、MDA和SOD含量的變化

組別nHYP(μg/mg)MDA(nmol/mgprol)SOD(U/mgprol)對照組80．39±0．141．72±0．34291．24±45．34模型組80．69±0．17a3．56±0．23a182．35±29．42a維拉帕米組80．47±0．13b2．50±0．47b221．77±39．72b

與對照組比較,a:P<0.01；與模型組比較，b:P<0.05

2.3 血漿和腎組織ET-1的檢測

模型組血漿和腎組織ET-1的含量與對照組相比顯著增高(P<0.01)，維拉帕米治療組與模型組相比則顯著減少(P<0.05)。見表2。

表2大鼠血漿及腎組織ET-1含量變化

組別n血漿ET?1(pg/mL)腎組織ET?1(pg/100mg)對照組839．8±7．13297．8±23．3模型組866．2±10．37a506．4±39．2a維拉帕米組850．7±6．16b392．5±11．8b

與對照組比較,a:P<0.01；與模型組比較,b:P<0.05

3 討 論

腎間質(zhì)纖維化是多種慢性腎臟疾病發(fā)展的共同結(jié)局，UUO模型是目前常用的腎小管損傷模型之一，腎間質(zhì)纖維化時，腎組織內(nèi)膠原纖維量增加，由于HYP為膠原纖維所特有，故常作為判斷纖維化程度的指標[5]。本文模型組大鼠UUO后8天梗阻腎病理呈現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化，HYP含量顯著高于對照組，而維拉帕米組腎間質(zhì)纖維化較模型組輕，HYP含量顯著低于模型組，證明維拉帕米可阻抑腎間質(zhì)纖維化。

目前認為，UUO模型腎臟病理損傷與腎缺血、低氧、血管緊張素Ⅱ、轉(zhuǎn)化生長因子β1、活性氧等產(chǎn)物誘發(fā)的損傷有關(guān)。脂質(zhì)過氧化使細胞膜完整性破壞，引發(fā)細胞周圍炎癥，丙二醛(MDA)是在氧自由基作用下發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應的一種產(chǎn)物，其本身也能破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)與功能，對細胞具有毒性，并能刺激間質(zhì)細胞膠原基因表達MDA量的變化提示體內(nèi)脂質(zhì)過氧化，間接反映細胞損傷的程度[6]。超氧化物酶(SOD)能清除超氧化物陰離子，可拮抗脂質(zhì)過氧化，其活力的高低可間接反映機體清除氧自由基的能力。因此，抑制已產(chǎn)生的自由基及加強抗自由基等方法可作為阻抑腎間質(zhì)纖維化有效的措施。

Ca2+促進細胞損傷的主要部位在質(zhì)膜、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞骨架系統(tǒng)，UU模型大鼠，血漿和腎組織中ET-1的濃度明顯增高，這與本研究一致，ET-1與特異的ET受體結(jié)合后，使腎內(nèi)小動脈出現(xiàn)較持續(xù)的收縮反應，還能促進胞內(nèi)鈣池釋放Ca2+，以及開放鈣通道，使Ca2+大量內(nèi)流，結(jié)果造成鈣超載和細胞壞死，并使腎血流量下降和腎小球濾過率降低。維拉帕米可與細胞膜上鈣通道結(jié)合，改變其通透性而阻止細胞外Ca2+內(nèi)流，并具有血管擴張效應而對抗ET-1的作用[7]，還具有干擾自由基損害的作用，因此可減輕腎間質(zhì)的損傷?？傊?，維拉帕米能夠阻抑Ca2+大量內(nèi)流，從而減少單側(cè)輸尿管梗阻大鼠脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，降低血漿和腎組織內(nèi)皮素-1的含量，增加抗氧化酶的含量，從而阻抑UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化。

[1] 韓紅,孫東,麻艷艷,等.單側(cè)輸尿管梗阻模型小鼠腎臟微血管損傷與腎間質(zhì)纖維化的關(guān)系研究[J].中國病理生理雜志，2010,26(12):2478-2481.

[2] 鄒赟，朱煒，邵命海,等.健脾清化方對5/6腎切除大鼠ATⅡ/NADPH氧化應激通路的干預作用[J].中南大學學報,2013,35(8):25-30.

[3] 林宗明，方銀忠，張永康,等.維拉帕米和超氧化物歧化酶對體外沖擊波腎損傷的保護作用[J].中華泌尿外科雜志，2014,24(2):93-95.

[4] 姜華茂,郭敏,張春陽,等.維拉帕米對ESWL所致腎損傷保護作用的實驗研究[J].遼寧醫(yī)學院學報,2009,30(5):405-406.

[5] 孫蔚楠,盧釗宇,謝院生,等.氯沙坦對腎間質(zhì)纖維化的抑制作用[J].中國中西醫(yī)雜志,2012,13(5):383-386.

[6] 張曉喧,李銀輝,鄭偉,等.單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化中氧化應激的變化[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2007,17(4):414-417.

[7] Topcu SO,Celik S,Erturhan S，et al.Verapamil prevents the apoptotic and hemodynamic change in response to unilateral ureteral obstruction[J].Int J Urol,2008,15(4):350-355.

Anti-fibrosisEffectofVarapamilonRatKidneywithUnilateralUreteralObstruction

WAN Qingsong,XIE Hongping,YANG Bo
(DepartmentofNephropathy,theFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate the effect of varapamil on kidney of rats with interstitial fibrosis after unilateal ureteral obstruction(UUO).MethodsTwenty-four rats were randomLy assigned to shame operation group(normal group),UUO group and varapamil treatment group after unilateral ureteral obstruction.Renal tissues were examined by light microscopy 8 days after operation.Hyd -roxyl puamino acid (HYP)，Malondiadehyde(MDA) and superoxide dismutase(SOD) content were measured.Endothelin (ET-1) was measured by radioimmunoassay.ResultsIn comparison with shame operation group,HYP and MDA content significantly increased,the level of plasmic and renal endothelin-1 significantly increased,SOD content significantly decreased(P<0.01).In comparison with UUO group,varapamil signicantly ameliorated what had mentioned (P<0.05).ConclusionsVarapamil can suppress renal interstitial fibrosis by reducing lipid peroxidation production and reducing the level of plasmic and renal endothelin-1 and improving antioxidative enzyme contents.

renal interstitial fibrosis； oxidative stress； endothelin-1； varapamil

2095-1116(2014)05-0440-03

2013-12-18

衡陽市科技局課題 (2009 KJ39).

萬青松，碩士，副主任醫(yī)師，副教授，研究方向：腎纖維化，E-mail:Wanqs40@sina.com.

R692

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(此文編輯：蔣湘蓮)