，， (南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖南 衡陽 421001)

miR-222下調(diào)高糖下小鼠系膜細(xì)胞TIMP3表達(dá)

劉應(yīng)蘭，曹仁賢，楊靖
(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖南 衡陽 421001)

目的探討miR-222是否通過靶向調(diào)控TIMP3表達(dá)參與糖尿病腎病的發(fā)生過程，從而進(jìn)一步揭示糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制。方法運(yùn)用qRT-PCR檢測經(jīng)25 mmol/L葡萄糖處理的小鼠系膜細(xì)胞(HG組)和對照小鼠系膜細(xì)胞(5 mmol/L葡萄糖，NG組)中miR-222和TIMP3的表達(dá)；將miR-222 mimics轉(zhuǎn)染小鼠系膜細(xì)胞，以TIMP3 siRNA為陽性對照，采用Western blot檢測其對TIMP3蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，miR-222在經(jīng)高糖處理的小鼠系膜細(xì)胞中的表達(dá)相對比正常濃度糖處理的小鼠系膜細(xì)胞中明顯上調(diào)，而TIMP3在經(jīng)高糖處理的小鼠系膜細(xì)胞中mRNA的表達(dá)相對比正常濃度糖處理的小鼠系膜細(xì)胞中明顯下調(diào)；Western blot結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-222或干擾TIMP3可抑制TIMP3蛋白的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論miR-222可能通過調(diào)控TIMP3的表達(dá)參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。

miRNA-222； 糖尿病腎??； 金屬蛋白酶組織抑制因子3

miRNAs是一類高度保守的非編碼小RNA分子，能與靶基因3′非編碼區(qū)特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致靶mRNA降解和翻譯阻遏[1]。miRNAs大約調(diào)控人類三分之一的蛋白編碼基因的表達(dá)。miRNAs調(diào)控很多重要的生物學(xué)過程，包括發(fā)育、細(xì)胞增殖和凋亡、細(xì)胞分化、代謝等[2]，并且在很多疾病中表達(dá)異常，包括糖尿病。金屬蛋白酶組織抑制因子3(TIMP3)是TIMPs家族成員之一。研究表明，TIMP3多態(tài)性與I型糖尿病腎病的發(fā)病明顯相關(guān)[3]，并且TIMP3在人糖尿病腎小球中差異表達(dá)[4]。研究表明，miR-222通過調(diào)控TIMP3參與胃癌的發(fā)生發(fā)展[5]。在高糖環(huán)境下，TIMP3在患糖尿病腎病的人和小鼠的腎臟中表達(dá)下調(diào)[6]。本研究擬通過采用qRT-PCR、熒光素酶報告系統(tǒng)以及Western blot檢測miR-222是否通過靶向TIMP3參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展，為進(jìn)一步闡明糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞處理

SV40 MES 13細(xì)胞系小鼠系膜細(xì)胞株，由中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)學(xué)研究所惠增。SV40 MES 13細(xì)胞用低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。消化細(xì)胞接種于6孔板中，分別用25 mmol/L葡萄糖(HG組)和5 mmol/L葡萄糖(NG組)處理SV40 MES 13細(xì)胞48 h。

1.2 主要材料

DMEM培養(yǎng)液購自invitrogen公司；miR-222 mimics與 scramble購自Exiqon公司；TIMP3 siRNA質(zhì)粒購自santa cruz公司；TIMP3抗體和β-actin抗體購自CST公司；Trizol和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；用于qRT-PCR的引物由invitrogen公司合成；qRT-PCR miRNA和mRNA Detection Kit購自廣州銳博生物技術(shù)公司。

1.3 qRT-PCR

采用Trizol法抽提細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)為20 μL體系，包括Taq DNA polymerase 5U/μL 0.2 μL，2×SYBR Mix 10 μL，miRNA RT product 2.0 μL，MiR-PCR primers(5 mmol/L)0.4 μL，滅菌蒸餾水7.4 μL。循環(huán)體系為:95°C 3 min,95°C 12 s，62°C 35 s,72°C 30 s,共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，所測定的mRNA的相對表達(dá)量采用2-ΔΔCT法分析。

1.4 Western blot

為了明確miR-222對TIMP3的蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)控，運(yùn)用將Western blot檢測外源表達(dá)miR-222對TIMP3蛋白表達(dá)水平的改變。將miR-222 mimics轉(zhuǎn)染SV40 MES 13細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染miR-222-scramble為陰性對照，轉(zhuǎn)染TIMP3 siRNA為陽性對照，轉(zhuǎn)染48 h后收集蛋白，并進(jìn)行蛋白濃度測定。各組取等量樣本，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉，加入TIMP3抗體或β-actin抗體，4 ℃過夜。TBST洗膜，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜，然后加ECL發(fā)光劑，X片曝光、顯影、定影。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 SV40 MES 13小鼠系膜細(xì)胞中miR-222和TIMP3表達(dá)水平的檢測

qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-222在高糖環(huán)境下SV40 MES 13細(xì)胞中的表達(dá)(2-△△CT)為4.173±0.072，在低糖環(huán)境下的SV40 MES 13細(xì)胞中的表達(dá)(2-△△CT)為0.528±0.132，NG組明顯低于HG組(P<0.05)；TIMP3在高糖環(huán)境下SV40 MES 13細(xì)胞中的表達(dá)為0.237±0.246，在低糖環(huán)境下的SV40 MES 13細(xì)胞中的表達(dá)為1.216±0.163，NG組明顯高于HG組(P<0.05)。

2.2 miR-222對TIMP3蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-222組TIMP3和TIMP3 siRNA組蛋白表達(dá)水平較陰性對照組明顯降低，提示，在SV40 MES 13小鼠系膜細(xì)胞中miR-222能下調(diào)TIMP3蛋白的表達(dá)(圖1)。

圖1 Western blot檢測外源表達(dá)miR-222對TIMP3蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

糖尿病腎病(DN)是慢性腎臟疾病的主要病因之一，在很大程度上促使了糖尿病患者的死亡率。從形態(tài)學(xué)上，糖尿病腎病主是以腎小管-間質(zhì)纖維化，腎小球基底膜增厚，系膜外基質(zhì)增生，從而導(dǎo)致纖維化，其主要原因是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的積聚所致。而細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)主要受基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)兩者之間的平衡所調(diào)控。TIMP3在腎臟中大多高表達(dá)，在小鼠中TIMP3表達(dá)缺失與炎癥、腎臟纖維化和腎小管間質(zhì)損傷相關(guān)[7-8]。TIMP3也是調(diào)節(jié)組織微環(huán)境包括控制炎癥和纖維化的關(guān)鍵因子[8-9]。眾所周知，炎癥在糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)理中起主導(dǎo)作用[10]，在人類或小鼠模型研究表明，TIMP3表達(dá)下調(diào)與糖尿病并發(fā)癥和代謝炎癥明顯相關(guān)[11-12]。

TIMPs和MMPs之間的動態(tài)生理平衡決定細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和組織微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。研究顯示，TIMP3是TIMPs家族中在腎臟中表達(dá)最高的一種[8]，TIMP3在小鼠中表達(dá)缺失，表現(xiàn)出對心肌病[13]和腎質(zhì)性腎炎和纖維化[8]的敏感性增高。研究表明，TIMP3表達(dá)缺失能加重糖尿病的腎臟損害，主要表現(xiàn)為腎臟的重量增加，腎小球系膜基質(zhì)增厚，尿蛋白排泄增加，而這些都是糖尿病腎病的早期特征[14]。TIMP3是MMP2活性的重要抑制因子[8,15]，在Akita糖尿病的小鼠腎臟中TIMP3表達(dá)缺失能導(dǎo)致MMP2的活性增強(qiáng)。

本研究通過qPT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，miR-222在高糖環(huán)境中的小鼠系膜細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，而TIMP3在高糖環(huán)境中的小鼠系膜細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。研究已證實(shí)TIMP3是miR-222直接調(diào)控的靶基因[16]，本實(shí)驗(yàn)還通過蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)證實(shí)了在小鼠系膜細(xì)胞中高表達(dá)miR-222能下調(diào)TIMP3蛋白的表達(dá)，表明TIMP3表達(dá)下調(diào)可能部分是由于miR-222表達(dá)上調(diào)所致。綜上所述，本研究通過證實(shí)miRNA-222在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控TIMP3的表達(dá)，從而參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展，為糖尿病腎病發(fā)展的可能分子機(jī)制提供了新的觀點(diǎn)，也為其治療提供了新的治療靶點(diǎn)。

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miR-222DownregulatestheExpressionofTIMP3inMouseHighGlucoseMesangialCells

LIU Yinglan,CAO Renxian，YANG Jing
(DepartmentofEndocrinology,theFirstAffiliatedHospital，UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo explicit whether miR-222 involved in diabetic nephropathy progression by targeting TIMP3,thus to reveal molecular mechanism of diabetic nephropathy.MethodsA qRT-PCR was conducted for detect the expression of miR-222 and TIMP3 mRNA in high glucose condition (25 mmol/L glucose) and normal glucose condition (5 mmol/L glucose)in SV40 MES 13 mouse mesangial cells.SV40 MES 13 mouse mesangial cells were transfected with miR-222 mimics,and TIMP3 siRNA as for positivecontrol,Western blot was performed to detect the expressions of TIMP3 protein.ResultsqRT-PCR showed that miR-222 was up-regulated in high glucose condition,however,the mRNA of TIMP3 was down-regulated in high glucose condition.Western blot showed that the expressions of TIMP3 protein was inhibited by transfected with miR-222 or siR TIMP3 in SV40 MES 13 mouse mesangial cells.ConclusionmiR-222 may involvedin diabetic nephropathy progression by regulating TIMP3.

miR-222; diabetic nephropathy; TIMP3

2095-1116(2014)05-0452-03

2014-03-26

劉應(yīng)蘭，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：糖尿病的發(fā)病機(jī)理，E-mail:42066645@qq.com.

R587.1

A

(此文編輯：朱雯霞)