，(.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 衡陽(yáng) 400；.南華大學(xué)生命科學(xué)研究中心)

P-糖蛋白1對(duì)宮頸癌化療耐藥的影響及機(jī)制

童文娟1，孫少衛(wèi)2
(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)生命科學(xué)研究中心)

目的探討P-糖蛋白1(P-gP)在宮頸癌細(xì)胞對(duì)依托泊苷耐藥中的作用機(jī)制。方法觀察不同分期宮頸癌組織和慢性宮頸炎組織中P-gP的表達(dá)差異。取Hela細(xì)胞分別用azithromycin和cyclosporine A處理6 h后，再與依托泊苷孵育不同時(shí)間，高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)依托泊苷含量。將Hela細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)皿或transwell小室中，用依托泊苷處理30 min，再分別與azithromycin和cyclosporine共孵育，檢測(cè)transwell下室培養(yǎng)液中依托泊苷含量，同時(shí)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況及凋亡相關(guān)因子Bcl-2和Bax的表達(dá)水平。結(jié)果P-gP在宮頸癌組織中表達(dá)顯著高于宮頸炎組織。azithromycin可增強(qiáng)依托泊苷對(duì)Hela細(xì)胞的損傷作用，并呈濃度依賴性地上調(diào)Bax表達(dá)，降低Bcl-2水平，而cyclosporine A則對(duì)Hela細(xì)胞有保護(hù)作用。Transwell培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，azithromycin增加Hela細(xì)胞層對(duì)依托泊苷的通透性，而cyclosporine A則降低其通透性。結(jié)論P(yáng)-gP促使Hela細(xì)胞泵出依托泊苷，減輕細(xì)胞損傷，因此介導(dǎo)了宮頸癌對(duì)依托泊苷的耐藥性。

P-糖蛋白1； 宮頸癌； 依托泊苷； Hela細(xì)胞

宮頸癌是女性常見的腫瘤之一，其死亡率居中國(guó)惡性腫瘤死亡率第4位，女性癌癥病死率第2位，女性生殖器腫瘤病死率的第1位[1]。近年來(lái)，隨著宮頸癌普查普治的開展，其病死率有所下降，但預(yù)后仍不盡人意，多藥耐藥是化療失敗的主要原因。依托泊苷(etoposide)為細(xì)胞周期特異性抗腫瘤藥物，作用于DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(Type II topoisomerase)，形成藥物-酶-DNA穩(wěn)定的可逆性復(fù)合物，阻礙DNA修復(fù)，導(dǎo)致DNA鏈斷裂[2]。由于腫瘤細(xì)胞分裂比正常細(xì)胞快，對(duì)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的依賴性更大，因此可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。依托泊苷常作為抗腫瘤藥用于肺癌、睪丸癌、淋巴瘤，淋巴細(xì)胞白血病等的治療[3]，但是單用于宮頸癌的化療效果并不明顯，具體機(jī)制還不清楚。P-糖蛋白1(P-glycoprotein 1,P-gP)，又名ATP結(jié)合盒蛋白B亞家族成員11(ATP-binding cassette,sub-family B 1,ABCB1)，是一種分子量170 kDa的跨膜糖蛋白，它具有能量依賴性“藥泵”功能。P-gP既能與藥物結(jié)合，又能與ATP結(jié)合，利用ATP供能將細(xì)胞內(nèi)藥物泵出細(xì)胞外，減低了細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，它介導(dǎo)了多種腫瘤細(xì)胞的化療耐藥性。本文探討P-gP是否參與了宮頸癌細(xì)胞對(duì)依托泊苷的耐受性及其耐藥機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

所用到的組織樣本來(lái)自南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，選擇2011年1月～2013年8月收住院行手術(shù)治療的宮頸癌患者，術(shù)前均無(wú)化療、放療及其他治療史，所有患者不合并其他炎癥性疾病，患者首次入院后按國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟2009年的標(biāo)準(zhǔn)確定宮頸癌的臨床分期。根據(jù)病理檢查結(jié)果將研究對(duì)象分三組，分別為宮頸癌II級(jí)(中分化鱗癌，非角化性大細(xì)胞型)、宮頸癌III級(jí)(低分化鱗癌，小細(xì)胞型)和子宮肌瘤合并慢性宮頸炎。選取宮頸癌II級(jí)和宮頸癌III級(jí)患者各40例，患者中位年齡52歲(31～69歲)。選擇同期因子宮肌瘤合并慢性宮頸炎行全子宮切除術(shù)的患者40例作為對(duì)照，年齡40～66歲，中位數(shù)年齡52歲，均經(jīng)病理檢查確診。所有患者均為中國(guó)漢族人，無(wú)親緣關(guān)系，并簽署知情同意書。收集上述患者術(shù)后宮頸病變組織，-70 ℃保存。人宮頸癌Hela細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。兔抗Bax一抗和兔抗Bcl-2一抗及羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

采用免疫組化鏈菌素親生物素——過(guò)氧化酶連接法(Streptavidin-Peroxidase assay，S-P assay)，S-P即用型試劑盒及即用型抗P-gP單克隆抗體均購(gòu)自福州邁新公司。將保存的癌組織和慢性宮頸炎組織自然解凍，所有標(biāo)本均經(jīng)體積分?jǐn)?shù)10%的中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟、水化后，進(jìn)行高溫高壓抗原修復(fù)，其它步驟按說(shuō)明書進(jìn)行。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人宮頸癌Hela細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5% CO2，Hela細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中。Transwell系統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)將Hela細(xì)胞以2×105/孔的密度種植到transwell內(nèi)培養(yǎng)套皿上(膠原包被的孔徑為0.4 μm的可滲透膜)，培養(yǎng)4天后可形成緊密細(xì)胞層用于實(shí)驗(yàn)[4]。

1.4 高效液相色譜(High-performance liquid chromatography，HPLC)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基中依托泊苷含量

利用MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide,MTT)實(shí)驗(yàn)確定依托泊苷處理后細(xì)胞存活率能達(dá)到80%時(shí)的最低濃度，以此濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。觀察azithromycin(5 mg/L) 或cyclosporine A (0.05 μmol/L) 處理后對(duì)Hela細(xì)胞內(nèi)依托泊苷含量的影響。實(shí)驗(yàn)3組：對(duì)照組直接用10 μmol/L依托泊苷處理；azithromycin組先用azithromycin處理細(xì)胞6 h后，換10 μmol/L依托泊苷繼續(xù)孵育；cyclosporine A組先用cyclosporine A處理細(xì)胞6 h后，換10 μmol/L依托泊苷繼續(xù)孵育，分別于0、30 min、1 h、3 h、6 h根據(jù)陸基宗等[5]文獻(xiàn)中方法測(cè)定依托泊苷含量。待細(xì)胞處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗3遍，加入0.1 mol/L NaOH 500 μL，反復(fù)凍融3次裂解細(xì)胞，8 000×g離心10 min，留上清進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)依托泊苷含量檢測(cè)，BCA試劑定量蛋白后，以200 μL最低濃度組的蛋白量為各組蛋白量標(biāo)準(zhǔn)，其他各組補(bǔ)齊體積至200 μL，7.2%三氯乙酸沉淀蛋白，以苯妥英鈉為內(nèi)標(biāo)并作標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定細(xì)胞內(nèi)依托泊苷含量。

將Hela細(xì)胞培養(yǎng)于transwell套皿中并形成緊密細(xì)胞層，根據(jù)處理因素不同將實(shí)驗(yàn)分為四組，分別為空白組、對(duì)照組、azithromycin組和cyclosporine A組。空白組未作任何處理，在對(duì)照組、azithromycin組和cyclosporine A組加入終濃度為10 μmol/L的依托泊苷使細(xì)胞攝取依托泊苷，孵育30 min后分別在azithromycin組和cyclosporine A組上層套皿中加入azithromycin或cyclosporine A，繼續(xù)孵育12 h，取套皿下層培養(yǎng)基檢測(cè)依托泊苷含量。直接從transwell培養(yǎng)體系中取200 μL培養(yǎng)基用于細(xì)胞外依托泊苷含量檢測(cè)。在200 μL待測(cè)液中加入苯妥英鈉至終濃度40 μg/mL，加1 mol/L HCL 0.1 mL混勻，再加氯仿(內(nèi)含8%異丙醇)2.5 mL，振蕩3 min，8 000 rpm離心10 min，取出下層，于45 ℃水浴中用氮?dú)饬鞔蹈?，?00 μL流動(dòng)相復(fù)溶，進(jìn)樣。

1.5 MTT法測(cè)定細(xì)胞活性

向96孔板分別加入100 μL 新鮮的DMEM 培養(yǎng)基,加入依托泊苷使終濃度分別為5、10、20、40、80 μmol/L，對(duì)照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)基。藥物作用24 h 后,加入MTT 儲(chǔ)存液( 5 mg/ mL) 10 μL/ 孔。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。棄掉各孔內(nèi)培養(yǎng)液,加入二甲基亞砜 100 μL/ 孔,振蕩器振蕩5 min 至細(xì)胞內(nèi)和周圍的顆粒充分溶解,室溫放置數(shù)分鐘，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定每孔吸光度值(490 nm) 。取3孔平均值計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.6 Western blot

將Hela細(xì)胞分為四組，分別為空白組、對(duì)照組、azithromycin組和cyclosporine A組。在對(duì)照組、azithromycin組和cyclosporine A組Hela細(xì)胞中加入10 μmol/L依托泊苷處理30 min后，將azithromycin組和cyclosporine A組Hela細(xì)胞分別用azithromycin或cyclosporine A繼續(xù)孵育24 h，檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況及凋亡相關(guān)因子Bcl-2和Bax的表達(dá)水平。在處理后的細(xì)胞中加入三去污劑裂解緩沖液進(jìn)行細(xì)胞裂解，于4 ℃離心10 min，棄除沉淀。BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，取70 μg蛋白質(zhì)用于聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)PDVF膜，封閉液封閉2 h，按1∶1 000加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗3次，按1∶1000的稀釋倍數(shù)加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h，TBST洗3次，暗室顯影，結(jié)果用凝膠成像分析系統(tǒng)分析，以目的蛋白帶與β-actin灰度值的比值進(jìn)行比較和半定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 P-gP在宮頸癌和宮頸炎組織中的表達(dá)差異

80例宮頸癌組織中，P-gP染色陽(yáng)性18例，陽(yáng)性率為22.5 %，40例宮頸炎組織中，P-gP染色陽(yáng)性3例，陽(yáng)性率為7.5 %(圖1)，P-gP在宮頸癌中陽(yáng)性比例明顯高于宮頸炎(P<0.05)，并且P-gP在晚期腫瘤組織中比早期腫瘤表達(dá)量更多。

圖1 免疫組化檢測(cè)宮頸癌和宮頸炎組織中P-gP的表達(dá)(SP×20) A：宮頸癌(II級(jí))組織；B：宮頸癌(III級(jí))組織；C：子宮肌瘤合并慢性宮頸炎組織

2.2 P-gP對(duì)Hela細(xì)胞內(nèi)依托泊苷含量的影響

經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)觀察到依托泊苷濃度為10 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率仍可達(dá)到80%，因此使用此濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。先用azithromycin (5 mg/L) 或cyclosporine A (0.05 μmol/L) 處理細(xì)胞6 h，加入終濃度為10 μmol/L的依托泊苷繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0、30 min、1 h、3 h、6 h檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)依托泊苷含量。發(fā)現(xiàn)30 min、1 h時(shí)細(xì)胞內(nèi)依托泊苷含量沒有明顯差異，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，azithromycin組和對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)依托泊苷含量逐漸下降(圖2)，cyclosporine A組細(xì)胞內(nèi)依托泊苷含量變化較小(P<0.05)。P-gP對(duì)Hela細(xì)胞攝取依托泊苷的過(guò)程影響較小，后期細(xì)胞內(nèi)依托泊苷含量的減少可能是由于細(xì)胞排出依托泊苷所致。

圖2 P-gP激活劑和抑制劑對(duì)Hela細(xì)胞內(nèi)依托泊苷含量的影響 與對(duì)照組比較，*：P<0.05

2.3 P-gP對(duì)Hela細(xì)胞排出依托泊苷的能力的影響

將Hela細(xì)胞培養(yǎng)于transwell套皿中并形成緊密細(xì)胞層，加入終濃度為10 μmol/L的依托泊苷使細(xì)胞攝取依托泊苷，孵育30 min后分別加入azithromycin或cyclosporine A，繼續(xù)孵育12 h，取套皿下層培養(yǎng)基檢測(cè)依托泊苷含量。結(jié)果顯示，對(duì)照組套皿下層培養(yǎng)基中依托泊苷含量為加入的依托泊苷總量的43%，用P-gP激活劑azithromycin處理后，依托泊苷透過(guò)Hela細(xì)胞層的量增加至62%，而經(jīng)P-gP抑制劑cyclosporine A處理則抑制依托泊苷通過(guò)Hela細(xì)胞層。

2.4 P-gP對(duì)依托泊苷促凋亡作用的影響及其對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)

在對(duì)照組、azithromycin組和cyclosporine A組Hela細(xì)胞中加入10 μmol/L依托泊苷處理30 min后，將azithromycin組和cyclosporine A組Hela細(xì)胞分別用azithromycin或cyclosporine A繼續(xù)孵育24 h，檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況及凋亡相關(guān)因子Bcl-2和Bax的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，依托泊苷導(dǎo)致Hela細(xì)胞凋亡發(fā)生，cyclosporine A進(jìn)一步促進(jìn)凋亡，而cyclosporine A能拮抗依托泊苷所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡(圖3)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)cyclosporine A處理后，凋亡相關(guān)基因Bax表達(dá)上調(diào)，而抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)降低，azithromycin的作用正好相反(圖4)。

3 討 論

宮頸癌是最常見的女性腫瘤死亡原因之一[6]。宮頸癌常規(guī)的治療方法是手術(shù)、放療或者兩者結(jié)合應(yīng)用，雖然近10余年來(lái)手術(shù)技巧、放療設(shè)備和技術(shù)在不斷改進(jìn)，但宮頸癌的治療效果并無(wú)根本性提高。5年生存率停留在40%左右[7]。近年來(lái)，宮頸癌發(fā)病年齡趨于年輕化，年輕患者對(duì)保留卵巢及性功能的要求也較高，更傾向于接受化療。由于宮頸癌對(duì)化療不敏感，尤其是宮頸鱗癌屬于對(duì)化療相對(duì)不敏感的腫瘤，化療僅用于晚期與復(fù)發(fā)患者的姑息治療[8]。腫瘤化療失敗的主要原因是細(xì)胞耐藥的產(chǎn)生。細(xì)胞耐藥既是正常細(xì)胞維持自身穩(wěn)定的防御機(jī)制之一，也是引起腫瘤化療失敗及腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因。易使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥的藥物多為天然的分子量較大的親脂性藥物，如蒽環(huán)類、長(zhǎng)春花堿類、鬼臼類、紫杉烷類等。腫瘤多藥耐藥的機(jī)制十分廣泛，P-gP是耐藥相關(guān)機(jī)制研究最早最深入的機(jī)制之一[9-10]。它于1976 年首先在對(duì)秋水仙堿耐藥的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢癌細(xì)胞上分離出來(lái)[11]。P-gP 是ATP 結(jié)合盒式結(jié)構(gòu)超家族成員，具有ATP 依賴性的藥物外排泵功能，能將藥物泵出細(xì)胞膜外而降低胞內(nèi)藥物濃度[12]。P-gP的表達(dá)與腫瘤的耐藥及預(yù)后密切相關(guān)，有研究者提出，膀胱癌患者P-gP表達(dá)與阿霉素耐藥明顯相關(guān)，且化療后殘留腫瘤的P-gP表達(dá)比未經(jīng)治療的腫瘤高5.7倍[13]。而晚期鼻咽癌患者P-gP陽(yáng)性者，則預(yù)示全身化療后總生存率較低[14]。

圖3 P-gP激活劑和抑制劑對(duì)依托泊苷介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響 1：空白組；2：對(duì)照組；3：azithromycin組；4：cyclosporine A組.與control組比較，*：P<0.05

圖4 P-gP激活劑和抑制劑對(duì)Hela細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)因子表達(dá)的影響 1：空白組；2：對(duì)照組；3：azithromycin組；4：cyclosporine A組

本文P-gP在宮頸癌組織中表達(dá)顯著高于宮頸炎組織，并且其表達(dá)水平與癌組織的分期密切相關(guān)。說(shuō)明P-gP可能是宮頸癌產(chǎn)生化療耐藥的分子機(jī)制之一。實(shí)驗(yàn)中利用鬼臼類抗腫瘤藥依托泊苷來(lái)探討宮頸癌細(xì)胞化療耐藥的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)將Hela細(xì)胞與依托泊苷共孵育短時(shí)間內(nèi)可增加細(xì)胞內(nèi)藥物含量，抑制或增強(qiáng)P-gP活性并不影響此過(guò)程，提示P-gP并不影響依托泊苷的攝入過(guò)程，但是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)藥物含量逐漸下降，當(dāng)抑制P-gP作用時(shí)，可維持細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，通過(guò)transwell培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)P-gP參與依托泊苷的泵出過(guò)程。同時(shí)也證實(shí)抑制P-gP功能確實(shí)增加了Hela細(xì)胞的凋亡。由此證實(shí)P-gP可能是宮頸癌化療耐藥的重要機(jī)制。

針對(duì)P-gP的耐藥機(jī)制，可以通過(guò)抑制P-gP的表達(dá)和活性來(lái)逆轉(zhuǎn)其引起的耐藥反應(yīng)。有研究[15]利用P-gP mRNA的反義寡核苷酸成功抑制了P-gP的表達(dá)，同時(shí)提高了惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U-87 MG細(xì)胞內(nèi)阿霉素的濃度?？鼓[瘤藥與P-gP抑制劑的聯(lián)用也可能增強(qiáng)抗腫瘤作用，研究證實(shí)cyclosporine A可與P-gP相互作用并抑制P-gP的泵出功能，當(dāng)cyclosporine A與P-gP合用可顯著增加細(xì)胞毒性[16]。近年來(lái)越來(lái)越多的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)藥物已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中顯示了良好的療效。隨著腫瘤耐藥機(jī)制的研究深入，腫瘤的耐藥性問(wèn)題將逐漸得到解決。

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P-glycoprotein1MdiatedtheResistanceofCervicalCancertoEtoposide

TONG Wenjuan,SUN Shaowei
(DepartmentofGynecologyandObstetrics,theFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate the roles of P-glycoprotein 1 on etoposide resistance of cervical cancer cells.MethodThe expression of P-glycoprotein 1 in cervical cancer and chronic cervicitis tissue were observed at different periods.The hela cells were treated with azithromycin (P-glycoprotein 1 activator) or cyclosporine A (P-glycoprotein 1 inhibitor) for 6 hours,then incubated with etoposide for different times.The content of etoposide in hela cells was detected by HPLC.Hela cells were grown on a Transwell insert to obtain a tight monolayer and preincubated with etoposide for 30 minutes,then incubated for another 12h after addition of azithromycin,or cyclosporine in the apical reservoir,HPLC was used to detect the content of etoposide in bottom reservoir.Hela cells were treated with azithromycin or cyclosporine for 24h after preincubated with etoposide,the cell viability was determined by MTT assay,Western blot was used to analyze the expression of apoptosis related proteins Bcl-2 and Bax.ResultsThe expression of P-glycoprotein 1 was significantly higher in cervical cancer tissues than in cervicitis,and its expression level was closely related with cancer staging.Azithromycin enhanced the cytotoxic effect of etoposide on hela cells,increased the expression of Bax,and decreased Bcl-2 in concentration-dependent manner,while cyclosporine A played a protective role on hela cells,up-regulated the expression of Bcl-2,and inhibited the expression of Bax.Transwell culture experiment showed that,azithromycin increased the permeability of HeLa cell layer to etoposide,but cyclosporine A prevented the passage of etoposide across cell layer.ConclusionP-glycoprotein 1 promoted HeLa cells to pump out etoposide,and relieved its cytotoxic effect,which therefore mediated the resistance of cervical cancer to etoposide.

P-glycoprotein 1； cervical cancer； etoposide； Hela cells

2095-1116(2014)05-0447-05

2013-11-02

童文娟，本科，主治醫(yī)師，研究方向：妊娠期高血壓，E-mail:tongwenjuan@chinaren.com.通訊作者孫少衛(wèi)，博士，講師，心血管藥理專業(yè)，E-mail:sunshaowei2004@126.com.

R737.33

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(此文編輯：蔣湘蓮)