楊 柳，張紅梅，徐嬌陽，王 瑞，劉鴻春，王 錚，余伍忠新疆石河子大學醫(yī)學院，新疆 石河子 83000；蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所,新疆 烏魯木齊830000

乙型肝炎病毒（HBV）為部分雙鏈環(huán)狀DNA病毒，基因組長約3.2 Kb，主要引起急、慢性肝炎、肝硬化和肝癌，是我國當前流行最廣泛、危害最嚴重的一種傳染病。HBV基因序列高度變異，主要與病毒本身生物學特性有關，根據(jù)全基因核苷酸序列異源性≥8%或S基因區(qū)核苷酸序列異源性≥4%，可將HBV分成8種（A-H）不同的基因型［1］，最近報道又新增了I型和J型［2-3］。大量證據(jù)表明，不同基因型的HBV的致病性存在差異，其基因型與乙型肝炎病情的進展、臨床表現(xiàn)、治療耐藥、預后有著密切的關系。國內外研究均發(fā)現(xiàn)HBV基因型具有明顯的地域性分布，在我國以C型和B型為主［4］。為此我們利用二代高通量測序平臺對新疆烏魯木齊和伊犁兩地區(qū)的回族和漢族HBV患者進行檢測，了解其基因型分布及與臨床病情的相關性，現(xiàn)報告如下：

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 血清標本來源 200例HBV感染血清分別于2012年9月和2013年1月采自新疆伊犁地區(qū)人民醫(yī)院和蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院的門診患者，包括回族94例，其中男性54例，年齡8～77歲，平均36.3±12.8歲，女性46例，年齡10～60歲，平均33.7±11.9歲；漢族100例，其中男性63例，年齡5～69歲，平均36.4±13.6歲，女性37例，年齡10～60歲，平均33.3±12.1歲。診斷符合2010年中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲分會、肝病學分會聯(lián)合修訂的“慢性乙型肝炎防治指南”診斷標準［5］。采用ELISA方法篩選HBsAg陽性者，分離血清置-20℃凍存?zhèn)錂z。所有病例血清甲、丙、戊、庚型肝炎病毒均為陰性，且入選對象均來自無親緣關系的回族、漢族人群，組間性別、年齡無顯著差異。

1.2 方法

1.2.1 乙肝五項檢測 HBV標記物（HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb）檢測嚴格按照酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒（上?？迫A生物工程股份有限公司）說明書操作。

1.2.2 HBV DNA定量檢測 病毒DNA提取采用簡易煮沸法：待檢血清100 μl加至0.5 ml離心管中，加入100μl病毒提取液A，振蕩混勻后13000r/min離心10min，吸棄上清，再加入25 μl提取液B，振蕩混勻后100℃干浴10 min，13 000 r/min 離心10 min，上清2 μl立即用于FQ-PCR檢測。實時熒光定量PCR嚴格按照試劑盒購自HBV定量PCR檢測試劑盒購自艾康生物技術（杭州）有限公司。

1.2.3 HBV DNA基因分型檢測 將HBV DNA定量檢測后的標本200例，送天津華大健康科技有限公司進行序列檢測，獲得分型結果194例。

1.2.4 HBV DNA測序分型結果判讀 根據(jù)HBV基因分型的標準：全基因組核苷酸序列差異≥8%或S基因序列差異≥4%，將HBV分為8個基因型，分別命名為AH。將檢測的HBV的DNA序列與NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/view.cgi?db=2）上的參考序列比對以獲得分型結果。

1.3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件處理，組間均值比較用單因素方差分析，樣本率或構成比的比較采用χ2檢驗，其他采用四格表資料的Fisher確切概率法，以P<0.05判定有無統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 新疆回族HBV感染者的分型結果及基因型與HBV-DNA含量的關系

HBV分型結果如圖1示。共獲得分型結果194例，其中回族94例，各基因型比例分別為：B型7例占7.44%，C型66例占70.21%，D型21例占22.34%。漢族100例，其各基因型比例分別為：B型23例占23%，C型57例占57%，D型12例占12%，B/C混合型8例占8%。未檢測到其他型別。4種分型在漢族和回族中總體分布不同（P<0.001）。漢族和回族中均以C型占優(yōu)勢，但4種基因型在漢族和回族中的總體分布不同：C型和D型在回族的分布頻率大于漢族，而B型和混合型在漢族中的分布頻率大于回族。HBV基因定量檢測結果顯示，回族中D型HBV DNA的拷貝數(shù)最低，B型最高；漢族B/C混合型HBV DNA的拷貝數(shù)最低?；?、漢族之間D基因型在HBV DNA拷貝數(shù)上有顯著差異（表1）。

圖1 HBV基因分型結果圖（從左至右依次為B、C、D和B/C混合型）

表1 回族患者HBV基因型分布及HBV DNA拷貝數(shù)比較

2.2 基因型與不同性別、年齡患者的關系

統(tǒng)計回、漢族男女性別各基因型結果表明，在94例回族標本中，男性感染者B、C、D型分別為5（5/7）、37（37/66）、8（8/21）、女性感染者分別為2（2/7）、29（29/66）、13（13/21）；漢族100例標本中男性感染者B、C、D及B/C混合型分別14（14/23）、36（36/57）、8（8/12）、5（5/8），女性感染者分別為9（9/23）、21（21/57）、4（4/12）、3（3/8）。兩民族基因型在性別上無明顯差異（P>0.05）。將所檢測的患者年齡劃分為≤30歲、30～50歲和≥50歲3個時段，比較不同年齡段回、漢族HBV各基因型分布情況，發(fā)現(xiàn)年齡段在兩民族間的分布不完全相同（χ2=19.579，P<0.01），≤30和≥50的比較有差異，即漢族中≤30歲的人數(shù)較多；30～50歲和≥50歲的比較有差異，即在漢族30～50歲間的分布較多，50歲以上患者分布最少（表2）。

表2 不同性別、年齡回族與漢族患者HBV基因型分布比較（n，×10-2）

2.3 不同類型HBV感染者基因型分布

回族94例中急性肝炎5例，無癥狀攜帶者22例，慢性乙型肝炎64例，肝硬化6例，肝細胞癌3例，其中有6例無癥狀攜帶者未分出型別。漢族100例中急性肝炎8例，無癥狀攜帶者3例，慢性乙型肝炎74例，肝硬化10例，肝細胞癌5例。通過對比顯示，感染分型在回族和漢族4種分型分布無差異（P=0.175和P=0.983），即感染分型在兩民族中分布均無統(tǒng)計學差異。5種臨床類型在4種分型分布中無差異（P=0.229）。HBV基因型在不同類型HBV感染者中的分布相同。不同病情患者基因型分布情況（表3）。

表3 不同類型HBV感染者中HBV基因型分布

3 討論

乙型肝炎病毒引起的是一種世界性疾病，由于人口素質和衛(wèi)生環(huán)境狀況的制約，在發(fā)展中國家的發(fā)病率明顯增高?；颊吒腥綡BV后，可能逐漸演變?yōu)楦鼮閲乐氐母尾?，如肝硬化、肝癌等，由此致使我國每年約50萬人死亡，占全球因感染HBV導致肝衰、肝硬化、肝癌及并發(fā)癥而死亡的總人數(shù)的一半，高達57.6%［6］。研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不同基因型HBV的傳播途徑和致病性存在差異，其基因型與乙型肝炎病情的進展、臨床表現(xiàn)、治療耐藥、預后有著密切的關系。目前多個國家的相關研究已證實在臨床參數(shù)中患者的人種和地理分布與HBV基因型之間的關聯(lián)強度最為密切［7］。通過HBV基因分型研究可以了解人口遷移并能更好地描述HBV感染的地理分布特點。以往研究認為：A型主要見于歐洲、美國白種人和黑種人、非洲黑種人/南非、亞洲、印度；B型主要分布于中國大陸南部、中國臺灣、越南、日本、美國亞裔；C型主要見于中國大陸北部、日本、中國臺灣、中國香港、泰國、美國亞裔；D型主要分布于白種人（南歐）、阿拉伯人（北非及中東地區(qū)）及印度；E型見于非洲西部和中部；F型存在于中南美洲、美國土著居民、波利尼西亞；G型流行于中美洲、美國、越南、法國、德國；H型見于尼加拉瓜、墨西哥、美國；最近發(fā)現(xiàn)的I型在越南和老撾，J型在琉球群島和日本。我國A、B、C、D等4個基因型都存在，北方城市以C基因型為主，由北至南，基因B型感染率逐漸升高，少數(shù)民族地區(qū)基因D型有較高的感染率［8］。

新疆自古以來就是一個多民族不斷遷徙、融合、同化的多元文化區(qū)域，各民族雜居混居現(xiàn)象較為普遍，不同源人群在相同環(huán)境條件下，可以朝相同方向演化而形成趨同的體質特征。遺傳物質DNA的核苷酸序列，在自然界以一定的頻率發(fā)生變異。因此人群間的遷徙與混雜及血緣關系對基因頻率是有影響的。新疆有十三個世居民族，回族是第四大民族，是典型的融生性民族，即回族源流的多元性與形成方式的融合性［9］。本研究HBV基因分型結果顯示，新疆漢族C型顯著高于B型，與文獻報道一致［10］?；刈?4例HBV樣品中，C型66例，D型21例，B型7例，未見基因型的重組，回族中C型占主導，其次D型也高達22.3%。明顯高于楊少奇等寧夏地區(qū)回族HBV基因分型中D型占4.2%的報道［11］；同樣與麗娜報道的新疆地區(qū)回族以B型為主D型次之，C型少見，且BC和CD混合型多見［12］；以及馮琴等研究的C型（71.43%），B型（14.29%），D型（7.14%）的結果都不一致［13］。出現(xiàn)這種差異我們認為首先是分型方法不同：目前用于HBV基因型分型的方法有多種，如基因序列測定法、聚合酶聯(lián)反應-限制性片段長度多態(tài)性基因分型法、單克隆抗體ELISA基因分型法、基因型特異性引物PCR法、線性探針分析基因分型法和基因芯片法等。各種方法都有自己的優(yōu)勢和局限，楊少奇等采用限制性片段長度多態(tài)性酶切分型法及部分測序分型，PCR-RFLP法［14］可因酶切位點易受基因變異影響，遇混合感染或酶切不完全時，會出現(xiàn)復雜條帶而影響結果判定。麗娜等采取基因型特異性引物巢式PCR法，由于選取的型特異性堿基聚集片段的保守性以及HBV DNA堿基變異等原因，會導致少數(shù)標本的擴增效應降低。在PCR過程中有時會出現(xiàn)污染等情況，形成非特異性條帶而導致誤判［15］；馮琴利用PCR反向斑點雜交法是一種較靈敏的快速檢測HBV基因型的分子雜交的方法，但是該方法所選擇的區(qū)段性檢測準確性可能受到HBV基因突變的考驗，同時其雜交區(qū)段過短，對于重組型的檢測準確性也受到一定的質疑［16］。隨著基因型概念的提出，測序成為主要鑒定基因型的方法，也是HBV基因分型的金標準和基礎。全基因序列分析不僅可靠，在基因分型的同時還可以了解不同基因型和不同株間的其它基因結構特征［17］。本研究中，我們采用的是HBV DNA的直接測序法，通過設計上游和下游各1個引物來對整條序列進行測序，該方法雖然操作比較復雜，但準確度高。其次是地區(qū)差異：在排除檢測方法學、試劑的靈敏度、特異性不同的基礎上，可能與地區(qū)差異、病例選擇、收集范圍、樣本數(shù)量不同有關。之前新疆地區(qū)少數(shù)民族HBV基因分型研究中回族樣本量較少，來源也較局限，僅占研究民族中稀少比例，未做到回族人群的專項研究，不能準確的體現(xiàn)該族群HBV基因型的真實情況。本組標本來源于烏魯木齊和伊犁兩地，樣本量較已有報道大幅增加，其結果的代表性更為廣泛，反應了新疆少數(shù)民族HBV基因型的地域分布和種族分布特點。但我們仍需擴大不同地區(qū)間的樣本量進行深入研究，進一步驗證是否地域不同就是形成基因型頻率差異的原因。

在楊少奇等［11］研究中納入了肝功能檢測指標作為肝臟損害評判指標，對寧夏回族HBV基因型分布進行研究，顯示感染C基因型的患者肝臟損害較明顯，并且與肝硬化、肝癌的關系更密切，而感染D基因型的患者肝臟損害較輕，預后可能較好。歐美研究表明，基因型D容易在較年輕的患者中發(fā)生原發(fā)性肝細胞癌，且D型與急性自限性肝炎相關。Oommen等［15］對249例慢性乙型肝炎兒童的研究發(fā)現(xiàn)，HBV DNA的高復制水平和基因型D密切相關。而國內童巧霞［20］等研究也顯示，基因型與臨床表型有關：基因型B、C及混合型在重型肝炎、肝硬化及肝癌患者中的分布存在差異，混合型和D基因型僅見于重型肝炎、肝硬化患者。上述研究與本研究結果不同，本研究顯示，漢、回族中基因型在臨床表型中分布相同。出現(xiàn)這種差異的原因主要有以下兩點：（1）本研究涉及肝臟，而肝臟自我修復力較強，病情一般發(fā)展較慢，尤其病情較輕時，病情發(fā)展更慢甚至恢復，或可解釋本研究出現(xiàn)的結果。且本研究中顯示慢性肝炎占五種臨床分型的絕對優(yōu)勢，占71.1%（P<0.001），也可佐證肝臟疾病一般發(fā)展較慢，多發(fā)展為慢性的情況；（2）致病性并不等同于臨床表型，目前普遍認為［18-21］基因型C引起的炎性壞死及纖維化程度比B型更加嚴重，且C型與肝硬化和肝癌的關系更為密切，基因型C的累積生存率要明顯低于B型。但這種致病性比較是否可以轉化為臨床表型比較，即具體基因型致病性與相應臨床表型的關系，未有統(tǒng)一共識。雖然越來越多的證據(jù)表明基因型致病性與相應臨床表型有關系，但要肯定具體基因型致病性與相應臨床表型的關系，還必須開展更多研究，包括大樣本的研究、短期及長期影響的研究、人群預后研究以及病理生理研究，以獲得大量令人信服的結果來證實這種關系；（3）不排除地域差異、樣本量、檢測方法、感染分型的分類標準等造成的不同結果。所以參考以上文獻并結合本研究對象的區(qū)域性特點，本研究結果可信，具有一定的科研價值，對于本地區(qū)流行病學資料也有一定補充。

總之，HBV基因型有著多種類型，目前研究人員對于HBV基因型的一些方面的認識還處于初級階段，很多領域還需要進一步深入。但我們希望通過新疆少數(shù)民族地區(qū)HBV感染者基因分型的研究，能夠對本地區(qū)HBV感染日常臨床診治工作、抗病毒治療療效相關性預測及慢性乙型肝炎患者個體化治療等起著重要的指導意義。

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