劉 凱 ，梁國(guó)校 ，楊 麒 ，韋秋思 ，梁文匯

（1.廣西林業(yè)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530002；2.天峨縣林業(yè)局，廣西 天峨 547300；3.廣西國(guó)營(yíng)雅長(zhǎng)林場(chǎng)，廣西 百色 452600）

油桐DGAT1基因在不同品種及種子發(fā)育階段的表達(dá)模式

劉 凱1，梁國(guó)校1，楊 麒2，韋秋思3，梁文匯1

（1.廣西林業(yè)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530002；2.天峨縣林業(yè)局，廣西 天峨 547300；3.廣西國(guó)營(yíng)雅長(zhǎng)林場(chǎng)，廣西 百色 452600）

應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR)技術(shù)，研究了油桐DGAT1在不同品種以及種子不同發(fā)育階段的表達(dá)模式。結(jié)果表明：DGAT1在6個(gè)不同品種成熟種子中的相對(duì)表達(dá)量差異不明顯，這種表達(dá)量與種仁含油率相關(guān)性也不明顯。在油桐‘ZNL-F52’種子不同發(fā)育階段中，DGAT1均有表達(dá)，在6、7、10月份表達(dá)量較低，而在8、9月份表達(dá)量高，相對(duì)表達(dá)量呈上調(diào)趨勢(shì)，這與油桐種仁油脂形成規(guī)律相符合，說(shuō)明該基因可能與油桐油脂合成調(diào)控有著密切的關(guān)系。

油桐；DGAT1基因；不同品種及種子；表達(dá)模式；實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)

油桐Vernicia fordii(Hemsl.)又名：三年桐、油桐樹(shù)、桐油樹(shù)等，屬大戟科落葉喬木。油桐籽可提煉桐油，是優(yōu)質(zhì)干性油，廣泛應(yīng)用于制漆、人造汽油、塑料、油墨等領(lǐng)域。油桐為我國(guó)四大木本油料樹(shù)種之一，且是中國(guó)特有的工業(yè)油料樹(shù)種[1-2]。 三 酰 甘 油 (Triacylglycerols，TAG) 是 油桐種子最主要的儲(chǔ)藏脂類，是桐油的主要成分。Kennedy途徑在TAG生物合成中起主導(dǎo)作用，二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(DGAT)是催化該途徑的最后一步，也是唯一的限速酶，因此直接影響TAG的累積[3]。研究表明，DGAT1基因在大多數(shù)高等植物的各器官中均有表達(dá)[4]。在大多雙子植物如擬南芥、油菜、大豆中，DGAT1基因在花瓣、花芽及發(fā)育中的種子中表達(dá)量高，而在莖段和葉片中表達(dá)量較低[3-6]；而在油桐和蓖麻的各器官中表達(dá)量差異不明顯[7]。基因表達(dá)分析對(duì)生物的基因功能研究具有重要意義，本試驗(yàn)對(duì)油桐DGAT1基因在油桐不同優(yōu)良家系（種仁含油率高低）以及種子不同發(fā)育階段的表達(dá)模式進(jìn)行研究，旨在揭示油桐DGAT1基因表達(dá)規(guī)律與其油桐種子含油率之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

材料取自湖南省永順縣青坪鎮(zhèn)中南林業(yè)科技大學(xué)油桐試驗(yàn)基地-國(guó)家油桐種質(zhì)資源保存庫(kù)。

1.1.1 油桐DGAT1在不同品種中表達(dá)量的研究

采集‘ZNL-F52’、‘ZNL-F37’、‘ZNL-F3’、‘ZNL-F13’、‘ZNL - F24’、‘ZNL-F20’ 等6個(gè)油桐家系品種的近成熟種子為研究對(duì)象。

1.1.2 油桐DGAT1在種子不同發(fā)育階段的表達(dá)模式

選用油桐優(yōu)良品種‘ZNL-F52’為研究對(duì)象，采集它的幼果（6月份）、幼果（7月份）、幼果（8月份）、幼果（9月份）以及近成熟果種子（10月份）作為研究材料。所有樣品取材后立即投入液氮速凍，隨后保存于-80℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 油桐種子含油率的測(cè)定

為研究DGAT1基因在不同油桐種仁含油率中表達(dá)規(guī)律，參照核磁共振法提取油桐油脂[8]。

1.2.2 總RNA的制備和cDNA第一條鏈的合成

采用龍洪旭[9]的改良TRIzol法作為提取油桐種仁RNA的方法，凝膠電泳檢查每個(gè)樣品總RNA質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)(Amersharm Biosciences)檢測(cè)濃度和純度。按Invirtogen公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄單鏈cDNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 靶基因及內(nèi)參基因的設(shè)計(jì)及反應(yīng)條件優(yōu)化

根據(jù)已公布的油桐DGAT1基因序列（GenBank登錄號(hào)DQ356680）、組成型表達(dá)的GAPDH基因（GenBank登錄號(hào)JQ680038）作為內(nèi)參。按照熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)特異引物（見(jiàn)表1），進(jìn)行基因擴(kuò)增引物和條件優(yōu)化，以確認(rèn)目的條帶的特異性和沒(méi)有引物二聚體。

表 1 基因的引物、產(chǎn)物大小、退火溫度Table 1 Primer of sequence, expected fragment size and annealing temperature

1.2.4 PCR循環(huán)數(shù)的確定

在優(yōu)化后的反應(yīng)條件下,利用內(nèi)參基因GAPDH特異性引物進(jìn)行不同循環(huán)數(shù)的PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)為：24、26、28、30、32、34、36；將等量的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，運(yùn)用凝膠成像系統(tǒng)的Gene Snap和Gene Tools軟件進(jìn)行成像和光密度分析。分別以PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)和產(chǎn)物的光密度值（OD）為橫、縱坐標(biāo)，確定內(nèi)參基因GAPDH基因擴(kuò)增的平臺(tái)期，保證PCR擴(kuò)增時(shí)內(nèi)參基因進(jìn)行處于其指數(shù)增長(zhǎng)期內(nèi)。同時(shí)調(diào)節(jié)內(nèi)參基因GAPDH的起始模板量，把不同待測(cè)材料的反應(yīng)起始模板量調(diào)整一致水平，利用DGAT1基因的特異引物，以調(diào)整后的cDNA為模板來(lái)確定DGAT1基因PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)。

1.2.5DGAT1基因的熒光定量PCR

以摸索好的‘ZNL-F52’等6個(gè)油桐品種種子及‘ZNL-F52’不同發(fā)育階段種子的cDNA模板量、循環(huán)數(shù)、最優(yōu)擴(kuò)增條件，采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)確定油桐DGAT1基因的相對(duì)表達(dá)含量，設(shè)計(jì)特意引物如表1，選取GAPDH為內(nèi)參基因，每組做三個(gè)平行重復(fù)檢測(cè)。RT-PCR反應(yīng)體系參見(jiàn)TaKaRa試劑說(shuō)明書(shū)，反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，58℃退火30 s，共30循環(huán)；所有PCR產(chǎn)物均經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)與進(jìn)行電泳圖光密度數(shù)據(jù)分析，并采用Bio-Rad CFX Manager軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘ZNL-F52’等6個(gè)油桐品種種子的油脂測(cè)定

采用核磁共振法提取‘ZNL-F52’、‘ZNL-F37’、‘ZNL-F3’、‘ZNL-F13’、‘ZNL - F24’、‘ZNL-F20’等油桐6個(gè)品種成熟種子的油脂，計(jì)算它們的種子的含油率，主要結(jié)果如表2所示：種仁含油率相對(duì)較高的有ZNL-F52、ZNL-F37，相對(duì)較低的有 ZNL-F24、ZNL-F20。

表2 不同油桐品種的果實(shí)經(jīng)濟(jì)性狀Table 2 Fruit economic characters of different tung oil tree species

2.2 RNA的提取

電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，28s和18s兩條帶清晰可見(jiàn)， A260/A280的比率約為1.8～2.0，表明RNA質(zhì)量能夠滿足RT-PCR的要求。

圖1 油桐不同品種及種子發(fā)育階段的總RNA提取Fig.1 Extracted total RNAs of different varieties and seed develop mental stages of V. fordii

2.3 RT-PCR循環(huán)數(shù)的確定

不同循環(huán)數(shù)的PCR擴(kuò)增結(jié)果：GAPDH基因從24個(gè)循環(huán)開(kāi)始表達(dá)量逐漸增加，30個(gè)循環(huán)后進(jìn)入平臺(tái)期，故可選擇30個(gè)循環(huán)作為內(nèi)參基因的PCR循環(huán)數(shù)；同時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)GAPDH的起始模板量，把不同待測(cè)材料的反應(yīng)起始模板量調(diào)整一致水平，在此基礎(chǔ)上，DGAT1基因的表達(dá)量在32個(gè)循環(huán)達(dá)到最大值，故選擇30個(gè)循環(huán)數(shù)作為DGAT1基因擴(kuò)增的最佳循環(huán)數(shù)。

2.4 油桐DGAT1基因在不同含油率種仁中的表達(dá)分析

為了研究VfDGAT1基因在不同品種（含油率高低）中表達(dá)量的差異，比較了VfDGAT1基因在‘ZNL-F52’等6個(gè)不同品種成熟種子中的表達(dá)情況。圖2結(jié)果顯示，該基因在6個(gè)不同品種成熟種子中的相對(duì)表達(dá)量差異不明顯，DGAT1轉(zhuǎn)錄水平從高到低依次為：ZNL-F13 (57.18%)＞ZNL-F52(65.32%)＞ZNL-F20(51.81%)＞ZNL-F3(60.10%)＞ZNL-F24(54.01%)＞ ZNL-F37(63.38%)，這種表達(dá)量與種仁含油率相關(guān)性也不明顯。

圖2 VfDGAT1在不同品種成熟種子中的轉(zhuǎn)錄水平Fig.2 Transcription levels of VfDGAT1 in defferent matured seeds

2.5 油桐DGAT1基因在種子不同發(fā)育階段的表達(dá)分析

VfDGAT1基因在油桐種子不同發(fā)育階段的表達(dá)差異情況（圖3），在油桐‘ZNL-F52’種子不同發(fā)育階段中，DGAT1均有表達(dá)，在6、7、10月份表達(dá)量較低，而在8、9月份表達(dá)量高，相對(duì)表達(dá)量呈上調(diào)趨勢(shì)，說(shuō)明該基因在油桐種子發(fā)育的中后期表達(dá)比較活躍。

圖3 VfDGAT1在種子不同發(fā)育階段中的表達(dá)模式Fig.3 Expression pattern of VfDGAT1 genes in different developing phases of seeds

3 討 論

油桐是我國(guó)特有的工業(yè)油料樹(shù)種，桐油不僅可以作為環(huán)保涂料和電子產(chǎn)品中大規(guī)模集成電路板浸漬劑，而且是制造生物柴油的優(yōu)質(zhì)原料[10]。隨著對(duì)新材料工業(yè)和能源的需要，極大推動(dòng)了DGAT基因的研究。Jako[11]等研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中AtDGAT1基因過(guò)量表達(dá)，DGAT1活性和表達(dá)量可以提高10%～70%，種子平均重量和含油率和明顯增加。在擬南芥Tag1基因插入突變體AS11中證實(shí)，不僅TAG含量以及油含量降低，而且TAG/DAG比值下降，脂肪酸組成也發(fā)生變化[12-13]。Zheng（2008）[14]發(fā)現(xiàn)一個(gè)苯丙氨酸插入高油玉米DGAT1-2蛋白的F469位點(diǎn)，可以明顯提高其油含量和油酸含量。

本試驗(yàn)對(duì)油桐DGAT1基因在油桐不同優(yōu)良家系（種仁含油率高低）以及種子不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式進(jìn)行初步研究發(fā)現(xiàn)，VfDGAT1在6個(gè)不同品種成熟種子中的相對(duì)表達(dá)量差異不明顯,這種表達(dá)量與種仁含油率相關(guān)性也不明顯，可能由于油脂的累積是受多個(gè)基因協(xié)調(diào)共同調(diào)控完成的；在油桐‘ZNL-F52’種子不同發(fā)育階段中，DGAT1均有表達(dá)，在6、7、10月份表達(dá)量較低，而在8、9月份表達(dá)量高，相對(duì)表達(dá)量呈上調(diào)趨勢(shì)，這與王漢濤[15]研究的油桐種仁油脂形成規(guī)律基本相符：7月份為緩慢形成期，7月底至8月底為迅速累積期，9月初至10月中為累積完成期，說(shuō)明該基因可能與油桐油脂合成調(diào)控有著密切的關(guān)系，為下一步油桐品種改良提供理論依據(jù)。

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Expression patterns of DGAT1 gene in different varieties and seeds developmental stages of Vernicia fordii

LIU Kai1, LIANG Guo-xiao1, YANG Qi2, WEI Qiu-si3, LIANG Wen-hui1
(1. Guangxi Academy of Forestry, Nanning 530002, Guangxi, China; 2.Tiane Forestry Bureau of Tianer County, Tianer 547300,Guangxi, China; 3. Yachang State Forest Farm of Guangxi, Baise 452600, Guangxi, China)

By using the real-time fluorescent quantitative PCR technique, the identification of expression ofDGAT1 in different vareties and seed developmental stages ofVernicia fordiiwas carried out. The results indicate thatDGAT1 relative expression quantity was no distinct differences in the sixV. fordiimatured seeds，and this expression was not obvious correlation with oil content;DGAT1 transcripts was relatively low from June to July, with higher levels on August, September and October, the relative expression quality were up-regulated in different stages of ‘ZNL-F52’ seeds and this was consistent withV. fordiiseed kernel oil formation law,which suggests that this gene may have a close relationship with the regulation of the synthesis of Tung oil.

Vernicia fordii;DGAT1 gene; different varieties and seeds; expression patterns; real-time quantitative PCR technique

S794.3

A

1673-923X(2014)10-0061-04

2014-05-06

林業(yè)公益性科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)子項(xiàng)目（201204403-1）

劉 凱（1987-），男，助理工程師，從事經(jīng)濟(jì)林生物技術(shù)方面的各項(xiàng)研究；E-mail：liukai4450024@163.com

梁文匯（1981-），男，高級(jí)工程師，從事經(jīng)濟(jì)林育種與栽培研究；E-mail：L.wenhui@163.com

[本文編校：吳 彬]