李祥棟，張明生，劉詩雅

（貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 貴州省藥用植物繁育與種植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025）

狐臭柴葉片中果膠提取條件的初步研究

李祥棟，張明生，劉詩雅

（貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 貴州省藥用植物繁育與種植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025）

以狐臭柴葉為原料、檸檬酸為酸解液提取果膠，采用單因素實(shí)驗(yàn)、正交實(shí)驗(yàn)對酸濃度、提取溫度、料液比和提取時間等條件進(jìn)行探索，并以響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計方法進(jìn)行工藝優(yōu)化。結(jié)果表明：酸濃度和料液比是影響果膠酸解的主要因子；一定范圍內(nèi)，酸濃度與果膠粗產(chǎn)率（Y1）呈線性正相關(guān)，料液比與果膠粗產(chǎn)率（Y1）呈線性負(fù)相關(guān)，二者與粗果膠半乳糖醛酸含量（Y2）的關(guān)系符合二元二次多項(xiàng)式方程模型，但隨著酸濃度的增加和料液比的降低，半乳糖醛酸含量有下降趨勢；半乳糖醛酸提取率（果膠有效提取率Y3）的擬合效果是一個平均值模型，即Y3=8.86%。在提取溫度、提取時間分別為90 ℃和120 min，響應(yīng)面的優(yōu)化條件為酸濃度3.91%、料液比1∶44.09時，果膠粗產(chǎn)率、半乳糖醛酸含量和果膠有效提取率分別為36.72%、32.09%和11.78%。

狐臭柴；果膠；半乳糖醛酸；提取條件

狐臭柴Premna puberulaPamp.又名神仙豆腐柴、斑鳩占等，隸屬于馬鞭草科Verbenaceae豆腐柴屬PremnaLinn.的直立或攀援灌木至小喬木，分布于我國西南、西北、華南、華中等地區(qū)。狐臭柴是一種藥食兼用植物，根、莖、葉中均含有多種藥用成分[1-3]；葉片中果膠、蛋白質(zhì)、纖維素、維生素等含量豐富[4-5]，民間采集其嫩葉和嫩枝制作成凝膠小吃，稱為“神仙豆腐”、“觀音豆腐”或“斑鳩飯”。狐臭柴葉片中果膠含量很高[6]，果膠是由α-半乳糖單體聚合而成的天然高分子化合物，通常被部分甲酯化，也有一些中性糖存在于果膠分子中[7-8]。在食品行業(yè)中，果膠被廣泛用作果醬、果凍等食品的增稠劑和穩(wěn)定劑。

有關(guān)狐臭柴的研究在國外幾乎未見報道[9]，國內(nèi)有部分學(xué)者在其果膠提取方面進(jìn)行了初步探索[10-12]，但此方面的研究仍然較少，大都采用單一的無機(jī)酸進(jìn)行熱萃取，效果欠佳，且所用無機(jī)酸均為非食用酸，存在食品安全隱患。有人曾用檸檬酸對蘋果渣和西番蓮果皮中的果膠進(jìn)行酸解提取[13-17]，效果較好。檸檬酸不僅因其3個解離常數(shù)不同的羧基而表現(xiàn)出較強(qiáng)酸性和緩沖能力，而且常用作飲品、點(diǎn)心等食品的調(diào)味劑。本實(shí)驗(yàn)采用檸檬酸提取狐臭柴葉片中的果膠，并對其提取條件進(jìn)行篩選和優(yōu)化，以期為狐臭柴中果膠的科學(xué)開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

狐臭柴Premna puberulaPamp.采自貴州省務(wù)川仡佬族苗族自治縣，經(jīng)貴州大學(xué)熊源新教授鑒定。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計

1.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

分別設(shè)置不同梯度的檸檬酸濃度（0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%）、提取溫度（60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃）、料液比即干葉粉與檸檬酸溶液之比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60）和提取時間（30 min、60 min、90 min、120 min、150 min），按照“實(shí)驗(yàn)方法1.3.2”的步驟（1）和（2）獲得酸解液，定容至500 mL，以間羥基聯(lián)苯法[16]測定酸解液中半乳糖醛酸含量并計算果膠提取率。

果膠提取率= 半乳糖醛酸含量/樣品質(zhì)量 ×100%。

1.2.2 正交實(shí)驗(yàn)

在分析以上單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計（表1），綜合評價不同因素水平組合對果膠提取率的影響及其主次關(guān)系，并篩選適宜的酸解條件。

1.2.3 響應(yīng)面設(shè)計

從節(jié)約原料的角度出發(fā)，基于上述單因素和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面法（RSM）設(shè)計原理進(jìn)行工藝參數(shù)優(yōu)化。選取檸檬酸濃度X1和料液比X2為自變量，果膠粗產(chǎn)率Y1（%）、粗果膠的半乳糖醛酸含量Y2（%）和果膠有效產(chǎn)率（半乳糖醛酸提取率）Y3（%）為響應(yīng)值，按中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計（CCD）安排實(shí)驗(yàn)因素和編碼水平（表2）。其提取流程見“實(shí)驗(yàn)方法1.3.2”。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 材料預(yù)處理

于狐臭柴生長旺季（6～9月），采集新鮮葉片，洗凈、晾干表面水分，置于105 ℃烘箱中殺青15～20 min后，迅速降溫至60 ℃烘干至恒重。將干葉片研磨成粉末并過60目篩，置于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 果膠酸解與提取

參照并改進(jìn)Pinheiro等[17]提取果膠的方法。

（1）酸解：稱取4.0～5.0 g（m）已制備好的狐臭柴干葉粉加入到具塞的500 mL大三角瓶中，分別加入相應(yīng)濃度和體積的檸檬酸溶液，按實(shí)驗(yàn)設(shè)定的水浴溫度進(jìn)行酸解。

（2）抽濾：將酸解液趁熱用1 mm孔徑的雙層紗布過濾并以布氏漏斗抽濾。

（3）沉淀：抽濾液以冷凍的等體積無水乙醇沉淀，4 ℃冰箱中靜置1 h使果膠懸浮。

（4）過濾、烘干及測定：過濾收集懸浮的果膠并以無水乙醇清洗干凈，45 ℃烘箱中烘干得到果膠粗品，磨細(xì)、稱重（m1），計算果膠粗產(chǎn)率（Y1）；以間羥基聯(lián)苯法測定粗品中半乳糖醛酸含量（Y2），并計算有效提取率（Y3，即半乳糖醛酸提取率）。

（5） 計 算 方 法：Y1=m1/m× 100%；Y3=Y1×Y2× 100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酸解條件對狐臭柴葉片果膠提取率的影響

酸濃度、溫度、料液比和提取時間等條件對狐臭柴葉片果膠提取率均有較大影響。

在檸檬酸濃度為0.5%～3.5%（pH 3.37～1.88）范圍內(nèi)，果膠提取率與酸濃度呈顯著正相關(guān)（檸檬酸濃度為3.5%時提取率最高，達(dá)9.20%）；當(dāng)檸檬酸濃度超過3.5%（pH 1.84）時，果膠提取率幾乎不再增加（圖1）。這與檸檬酸pH的變化緊密關(guān)系（圖1），低濃度的檸檬酸可迅速解離釋放H+，而高濃度時解離速率變慢，從而影響其化學(xué)活性。

在一定范圍內(nèi)，果膠提取率隨溫度升高（60～80 ℃）而大幅度增加，這與分子熱運(yùn)動加劇和檸檬酸的解離程度增大有關(guān)；當(dāng)溫度高于80 ℃后，果膠提取率趨于穩(wěn)定（圖2）。料液比對酸解效果的影響較為明顯，料液比過大（即干葉粉相對過多）不能使果膠完全酸解出來，提取率較低；隨著料液比降低（即檸檬酸體積增大），果膠提取率也隨之增高（圖3），可能是因?yàn)镠+與果膠分子糖苷鍵的作用頻率增大所致；但當(dāng)料液比降低到一定限度后（小于1∶50），果膠提取率逐漸降低，這可能是酸度相對過高造成的抑制作用。提取時間對酸解效果影響不是很大，但時間過長會使果膠提取率降低（圖4），這可能與半乳糖醛酸的部分降解有關(guān)。

圖1 酸濃度對果膠提取率的影響Fig. 1 Effects of acid concentration on pectin extraction ratio

圖2 酸解溫度對果膠提取率的影響Fig. 2 Effect of temperature on pectin extraction ratio

圖3 料液比對果膠提取率的影響Fig. 3 Effect of solute/solvent on pectin extraction ratio

綜上，在檸檬酸濃度為2.5%～3.5%、提取溫度為80～90 ℃、料液比為1∶40～1∶50、提取時間為90～120 min范圍內(nèi)，狐臭柴干葉粉酸解效果較好，其果膠提取率較高。

圖4 酸解時間對果膠提取率的影響Fig. 4 Effect of time on pectin extraction ratio

2.2 狐臭柴葉片果膠酸解提取的適宜條件

通過不同因素水平組合實(shí)驗(yàn)，即L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1?？梢钥闯觯煌幚黹g存在顯著或極顯著差異，處理7對狐臭柴葉片果膠的提取率最高（11.42%），即檸檬酸濃度3.5%、提取溫度85 ℃、料液比1∶50、提取時間90 min的因素水平組合是狐臭柴葉片果膠酸解提取的適宜條件。極差分析與方差分析結(jié)果顯示，各因素對果膠提取率的影響順序?yàn)樗釢舛龋ˋ）＞料液比（C）＞溫度（B）＞時間（D），除提取時間外，其他因素的影響均達(dá)到顯著或極顯著水平。在一定的溫度和時間范圍內(nèi)，酸濃度和料液比是影響狐臭柴葉片果膠提取率的主要因素。

表 1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的極差及方差分析?Table 1 ANOVA and range analysis for orthogonal experimental results

2.3 狐臭柴葉片果膠提取的響應(yīng)面分析

不同變量水平組合及不同處理?xiàng)l件下的實(shí)驗(yàn)響應(yīng)值（Y1、Y2、Y3）見表2，果膠粗產(chǎn)率（Y1）和半乳糖醛酸含量（Y2）的回歸方程分別為（1）、（2）。

由回歸方程可知，酸濃度、料液比和果膠粗產(chǎn)率表現(xiàn)出來的是一種線性關(guān)系，而與半乳糖醛酸含量的關(guān)系是非線性關(guān)系。方差分析結(jié)果（表3）表明，方程（1）的X1項(xiàng)回歸系數(shù)和回歸模型達(dá)到顯著水平，X2項(xiàng)回歸系數(shù)差異不顯著；方程（2）的X1、項(xiàng)的回歸系數(shù)和回歸模型均達(dá)到顯著水平，而其他項(xiàng)的回歸系數(shù)差異不顯著。由此可知，酸濃度是影響粗果膠產(chǎn)率和半乳糖醛酸含量的主要因素，而且它與料液比的交互作用較弱。另外，方程（1）和方程（2）的失擬p值分別為0.118 3和0.070 1，均大于0.05，都沒有失擬，說明兩個擬合方程的可信度較好。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果?Table 2 Scheme and experimental results of response surface methodology

表3 果膠粗產(chǎn)率和半乳糖醛酸含量的響應(yīng)面模型及其回歸系數(shù)（編碼制）的方差分析?Table 3 Response surface model and ANOVA for coded regression coefficients both GalA content and extraction ratio of gross pectin

從果膠粗產(chǎn)率和半乳糖醛酸含量的響應(yīng)面三維圖（圖5、圖6）可以看出，果膠粗產(chǎn)率隨著酸濃度增加和料液比降低而增加，在酸濃度3.91%（+1.414）、料液比1∶40（+1）時的果膠粗產(chǎn)率最高可達(dá)36.20%；半乳糖醛酸含量的變化卻呈相反趨勢。上述變化趨勢可能是因?yàn)殡S著酸濃度及其體積的增大，狐臭柴葉片中的可溶性糖、無機(jī)離子等被大量酸解出來，沉淀過程中它們和果膠一起凝膠并析出，從而使果膠粗產(chǎn)率增加而半乳糖醛酸含量相對減少。然而，有效產(chǎn)率的數(shù)學(xué)模型測試結(jié)果卻是一個平均值模型，即Y3=8.76%，與單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果有矛盾之處，這很可能與半乳糖醛酸的不完全沉淀有關(guān)。

圖5 果膠粗產(chǎn)率的3D響應(yīng)面Fig. 5 Three-dimensional diagram of response surface on extraction ratio of gross pectin

通過綜合分析酸濃度和料液比對響應(yīng)值（Y1、Y2、Y3）的影響，本實(shí)驗(yàn)篩選出狐臭柴葉片果膠提取的優(yōu)化條件為檸檬酸濃度為3.91%、料液比為1∶44.09，此時果膠粗產(chǎn)率、半乳糖醛酸含量、果膠有效提取率分別為36.72%、32.09%和11.78%。

圖6 半乳糖醛酸含量的3D響應(yīng)面Fig. 6 Three-dimensional diagram of response surface on GalA content

3 討 論

響應(yīng)面法是通過一系列確定性的“試驗(yàn)”擬合一個響應(yīng)面來模擬真實(shí)極限狀態(tài)曲面，其基本思想是通過近似構(gòu)造一個具有明確表達(dá)形式的多項(xiàng)式來表達(dá)隱式功能函數(shù)[18]。本質(zhì)上說，響應(yīng)面法是一套統(tǒng)計方法，用這種方法來尋找最佳響應(yīng)值，它能在曲面上直觀地表現(xiàn)出優(yōu)化區(qū)域，因此在工藝優(yōu)化[19-24]方面表現(xiàn)出很好的優(yōu)勢。本研究的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果顯示，無論是果膠粗產(chǎn)率的線性模型還是半乳糖醛酸含量的二元二次方程模型的模擬效果都比較合理。單因素和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證明，在一定的酸濃度和料液比范圍內(nèi)，增加酸濃度和降低料液比可使半乳糖醛酸的提取率（果膠有效提取率）增加，但其響應(yīng)面分析的結(jié)果卻是個平均值模型，這顯然有相悖之處，其中的差別可能是因提取流程延長所引起，因?yàn)轫憫?yīng)面分析法提取果膠的流程中增加了乙醇沉淀等步驟，沉淀不完全或收集過程中的損失，最終都會影響有效提取率。不同濃度的檸檬酸處理后，其酸解液的pH也有差別，由此也會影響半乳糖醛酸的沉淀效果。Kalapathy等[21]對大豆皮果膠沉淀?xiàng)l件的探討結(jié)果表明，當(dāng)沉淀液的pH為3.5時，果膠沉淀率最高，pH過高或過低均會影響其沉淀效果。另外，果膠酯化程度也可能影響凝膠沉淀效果，因?yàn)轷ユI可改變果膠分子間的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，高酯化度果膠通過半乳糖醛酸殘基形成的氫鍵和甲氧基之間的疏水相互作用交聯(lián)形成凝膠，而低酯化度果膠凝膠的分子基礎(chǔ)是羧基結(jié)合Ca2+等無機(jī)離子而形成交聯(lián)區(qū)，其中無機(jī)離子發(fā)揮了中介離子的作用[22]。因此，果膠酯化度也可能是影響果膠沉淀效果不可忽略的因素。寧海鳳等[23]采用超聲波協(xié)同酸解的方法對果膠提取條件的實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為，超聲波協(xié)同酸解處理可以縮短提取時間并增強(qiáng)提取效率。此外，在沉淀步驟之前對酸解液進(jìn)行一定程度的濃縮，對于原料的利用可能會更加經(jīng)濟(jì)，這方面值得進(jìn)一步研究。

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Preliminary study on pectin extraction in leaves of Premna puberula Pamp.

LI Xiang-dong, ZHANG Ming-sheng, LIU Shi-ya
(Guizhou Key Lab. of Propagation and Cultivation in Medicinal Plants, College of Life Sciences, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

Citric acid was used to extract the pectin ofPremna puberulaleaves. Through single factor experiments and orthogonal design,the extraction process was studied involving four factors (acid concentration, extracting temperature, solute/solvent ratio and extracting time). The response surface methodology (RSM) was used to optimize the process of pectin extraction. The results show that the acid concentration and solute/solvent ratio were two key factors affecting pectin extraction ratio; within a certain range, acid concentration and pectin crude yield (Y1) was a positive linear correlation, solute/solvent ratio and pectin crude yield (Y1) was a negative linear correlation,the relationship both acid concentration and solute/solvent with galacturonic acid (GalA) content (Y2) of the crude pectin accorded with the model of binary quadratic polynomial equation; and GalA content had a downward trend with increase of acid concentration and decrease of solid-liquid ratio; the fi tting effect of GalA extraction ratio (pectin effective extraction ratioY3) was an average model, i.e.Y3= 8.86%;the pectin crude yield, GalA content and pectin effective extraction ratio were respectively 36.72%, 32.09% and 11.78% at 90℃ (extracting temperature), 120 min (extracting time), acid concentration 3.91% and solute/solvent ratio 1∶44.09.

Premna puberulaPamp.; pectin; galacturonic acid; extracting condition

S789.2

A

1673-923X(2014)10-0127-05

2013-09-19

貴州省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目（黔教科[2011]043號）；貴州大學(xué)研究生創(chuàng)新基金（農(nóng)科2012008）；貴州省“科技興村行動”計劃項(xiàng)目（黔組通[2008]66號）和貴州省中藥材現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目（GZCYTX-02）資助

李祥棟（1987-），男，山東臨沂人，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锷砼c分子調(diào)控

張明生（1963-），男，重慶人，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究領(lǐng)域?yàn)橹参锷锛夹g(shù)與次生代謝調(diào)控；

E-mail：mszhang@gzu.edu.cn

[本文編校：文鳳鳴]