張 弦， 王友平， 劉 璐， 劉 健

（合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

在哺乳動物體內(nèi)，固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBPs）作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，啟動了下游脂質(zhì)合成基因的表達，從而調(diào)控了膽固醇、脂肪酸和甘油三酯的合成［1］。哺乳動物體內(nèi)包括SREBP－1a、SREBP－1c、SREBP－2形式的SREBP。SREBP－1a和SREBP－1c主要參與脂肪酸的合成，而SREBP－2主要調(diào)控膽固醇合成相關(guān)基因和LDLR基因［2－6］。SREBP前體是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成的，活化時前體裂解釋放出成熟形式，成熟的SREBP轉(zhuǎn)運到細胞核中與靶基因固醇調(diào)節(jié)元件（SRE）結(jié)合，從而增強其表達，進而導(dǎo)致脂質(zhì)合成的增加［7－8］。該過程受到一系列相關(guān)活性物質(zhì)（如固醇類物質(zhì)）的嚴格調(diào)控。當細胞內(nèi)固醇水平低時，SRBEPs裂解激活蛋白 （SREBPs－cleacageactivating protein，簡稱SCAP），運送SREBP到高爾基體中進行裝配，由2個水解蛋白S1P（site 1protease）和S2P（site 2protease）進行裂解，釋放出成熟的SREBP，轉(zhuǎn)運到細胞核中激活目的基因。而當固醇水平較高時，膽固醇和氧化固醇（如25－羥基膽固醇）刺激SCAP和Insig蛋白（insulin－sensitive protein）結(jié) 合，導(dǎo) 致 SCAPSREBP復(fù)合物在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中滯留，進而降低成熟的SREBP，導(dǎo)致脂質(zhì)合成基因表達的降低。

由于調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成的SREBP靶標是SRE元件，因此可以通過檢測SRE元件的活性，評價相關(guān)活性調(diào)節(jié)物質(zhì)對SREBP活性的影響，預(yù)測其對脂質(zhì)代謝的作用［9－10］。本文擴增或人工合成了人LDLr基因啟動子區(qū)域SRE元件1次重復(fù)片段或3次重復(fù)片段，將之插入熒光素酶報告基因載體pGL3－basic中，構(gòu)建了2種含有人SRE元件的熒光素酶報告質(zhì)粒。將這些質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到人肝癌細胞 HepG2中［11－12］，通過具有顯著增強作用的胰島素［9］、明顯抑制作用的膽固醇和25－羥基膽固醇［10］驗證了所構(gòu)建報告質(zhì)粒的活性。

1 材料與方法

1.1 試劑材料

pGL3－basic載體和雙熒光素酶報告質(zhì)粒檢測試劑盒購自Promega公司；pRLTK質(zhì)粒本實驗室保藏；HepG2購自北京協(xié)和細胞資源中心；血液基因組提取試劑盒購自康為世紀生物公司；膠回收試劑盒購自Axygen公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自上海生工公司；FBS、opti－MEM和DMEM購自Gibco公司；Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司。限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶和LA Taq酶購自TaKaRa公司。

1.2 方 法

1.2.1 SRE元件1次重復(fù)片段引物設(shè)計

利用PrimePrimer5.0軟件設(shè)計擴增人的LDLr啟動子的引物如下：

其中，上游引物中加入KpnⅠ的酶切位點，下游引物中加入XhoⅠ的酶切位點。PCR擴增人LDLr（－699～＋45）啟動子片段，長度為744bp。

1.2.2 人SRE元件目的片段的合成

按照血液基因組提取試劑盒的說明書提取人血液基因組DNA。以人基因組DNA為模板，利用設(shè)計的上下游引物擴增含有SRE元件的LDLr啟動子DNA序列。反應(yīng)體系為LA Taq酶0.15μL、2×GC Buffer12.5mL、dNTP 2μL、上游引物1μL、下游引物1μL、DNA模板1μL、雙蒸水7.35μL。PCR循環(huán)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸5min［13］。將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測。

人工合成的SRE 3次重復(fù)序列［6］如下：

在該序列兩端加入KpnⅠ和XhoⅠ的酶切位點。

1.2.3 熒光素酶重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

所擴增的LDLr啟動子區(qū)域PCR產(chǎn)物、人工合成的SRE 3次重復(fù)序列和pGL3－basic載體，使用KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切后，用T4DNA連接酶進行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109，挑取陽性克隆菌落擴大培養(yǎng)。PCR驗證陽性菌落，按照無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒進行質(zhì)粒DNA抽提，－20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 細胞的培養(yǎng)與瞬時轉(zhuǎn)染

HepG2細胞在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM，每2天更換1次培養(yǎng)基，細胞融合時用0.25%的胰酶進行消化傳代，接種到96孔板備用。

將細胞接到96孔細胞培養(yǎng)板上24h，細胞密度達到融合時，使用無血清無雙抗的DMEM處理過夜。按照每孔加入50μL含有0.25μg pGL3質(zhì)粒DNA、0.05μg pRLTK質(zhì)粒DNA和0.75μL脂質(zhì)體的opti－MEM進行轉(zhuǎn)染6h。轉(zhuǎn)染后，加入無血清無雙抗DMEM，恢復(fù)過夜。然后，加入胰島素10μg／mL或25－羥基膽固醇2.5μmol／L和膽固醇25μmol／L，處理24h后，進行熒光素酶活性檢測。

1.2.5 熒光素酶活性檢測

除去培養(yǎng)基，用1×PBS清洗細胞。然后按推薦體積每孔加入1×PLB 20μL到96孔板中，放在細胞震蕩儀上震蕩裂解15min。將所得細胞裂解液移入酶標板中，加入LARII 100μL?；靹蚝螅捎肨hermo Scientific Fluoroskan Ascent熒光和化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測。其后，加入等體積的1×Stop ＆Glo Buffer混勻，再檢測。熒光素酶相對活性由第1次測得pGL3熒光活性和第2次測得pRLTK熒光活性的比值表示。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)標準差表示。由SPSS13.0統(tǒng)計軟件，進行不同組之間的t檢驗，雙側(cè)P＜0.05為統(tǒng)計學(xué)意義的顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 人SRE片段的結(jié)構(gòu)設(shè)計

參照人LDLr基因啟動子序列，本文設(shè)計了2種含有SRE元件的報告基因：① 含有SRE 1次重復(fù)的LDLr啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒（pGL3－basic－SRE1）；② 人工合成的SRE 3次重復(fù)的熒光素酶報告質(zhì)粒（pGL3－basic－SRE3）。具體質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。

圖1 SRE的熒光素酶報告基因結(jié)構(gòu)示意圖

2.2 人SRE元件報告質(zhì)粒的構(gòu)建

本文從人的血液中提取并獲得了約23kbp的人血液基因組DNA如圖2所示。圖2中，M代表λDNA／HindⅢMarker，1代表人血液基因組DNA。PCR擴增了含有SRE元件的LDLr啟動子片段（－699～＋45），長度為744bp，如圖3a所示。所得人LDLr啟動子SRE 1次重復(fù)序列和人工合成的SRE 3次重復(fù)序列，經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切后，分別 插 入 pGL3－basic 載 體。pGL3－basic－SRE1 經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切和PCR驗證后，再經(jīng)測序驗證，如圖3所示。pGL3－basic－SRE3經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切，再進行測序驗證。圖3中，M代表200bp DNA Marker；圖3a中1代表PCR擴增LDLR啟動子序列產(chǎn)物，2代表驗證引物PCR檢測空載體結(jié)果，3代表pGL3－basic－SRE1PCR驗證結(jié)果；圖3b中1和2分別代表pGL3－basic－SPE1和pGL3－basic－SRE3雙酶切產(chǎn)物。

圖2 人血液基因組DNA

圖3 PCR擴增LDLr啟動子和人SRE元件報告質(zhì)粒電泳圖

2.3 人SRE元件熒光素酶報告質(zhì)粒活性的測定

本文檢測了SRE元件熒光素酶報告質(zhì)粒的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性，如圖4所示。由圖4可看出，在轉(zhuǎn)染到 HepG2細胞后，pGL3－basic－SRE1和pGL3－basic－SRE3活性均比空載體pGL3－basic的活性有顯著提高，說明在HepG2細胞中，SRE元件的報告質(zhì)粒具有較高的轉(zhuǎn)錄活性。

圖4 pGL3－basic－SRE1和pGL3－basic－SRE3的轉(zhuǎn)錄活性

胰島素對SRE元件有激活作用［9］，而25－羥基膽固醇與膽固醇結(jié)合能抑制SRE元件活性［10］。因此，本文檢測了胰島素和25－羥基膽固醇／膽固醇對SRE元件熒光素酶報告質(zhì)?；钚缘挠绊懀鐖D5和圖6所示。

圖5 胰島素和25－OH／CHO對SRE1活性的影響

結(jié)果表明，10μg／mL胰島素處理，活化了2種SRE元件的活性；而2.5μmol／L 25－羥基膽固醇和25μmol／L膽固醇結(jié)合處理，抑制了SRE元件的活性。在上述2項處理中，處理試劑對pGL3－basic－SRE1 的 作 用 均 比 對 pGL3－basic－SRE3的作用更強烈。

圖6 胰島素和25－OH／CHO對SRE3活性的影響

3 結(jié) 論

SREBP通過與靶基因SRE元件結(jié)合來調(diào)節(jié)膽固醇和脂質(zhì)合成。因此，可以通過檢測一些活性物質(zhì)對SRE元件的應(yīng)答來初步判斷該物質(zhì)是否影響脂質(zhì)合成，進而預(yù)測SREBP相關(guān)活性物質(zhì)的作用機制［10］。報告質(zhì)粒在研究中經(jīng)常被用在測定啟動子對基因表達的影響［13］。其一般步驟包括：① 將目的基因調(diào)控序列或效應(yīng)元件克隆并插入含報告基因的質(zhì)粒中；② 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細胞系；③ 測定報告基因的表達水平，從而評價在調(diào)控序列指導(dǎo)下對靶基因表達可能的誘導(dǎo)作用。

本文通過克隆和人工合成了人LDLr啟動子SRE 1次重復(fù)序列和SRE 3次重復(fù)序列，將其分別插入pGL3－basic vector載體中，構(gòu)建了pGL3－basic－SRE1和 pGL3－basic－SRE3熒光 素 酶 報 告質(zhì)粒，將其分別轉(zhuǎn)染到人肝癌細胞HepG2中進行檢測［11－12］。胰島素處理顯著活化SRE元件，而25－羥基膽固醇和膽固醇結(jié)合處理顯著抑制SRE元件的活性，說明本文所構(gòu)建的SRE元件報告質(zhì)粒具有活性，能成功地反映SREBP活性的改變。胰島素、25－羥基膽固醇與膽固醇結(jié)合對pGL3－basic－SRE1的效應(yīng)作用都比對pGL3－basic－SRE3的作用強。這是因為REBP對SRE元件的效應(yīng)作用可能也需要其他元件的參與，而不僅是與SRE元件的單獨作用［4］。

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