夏金嬋， 何奕昆

(1.河南中醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，河南 鄭州 450008;2.首都師范大學生命科學學院，北京 100048)

低溫是植物經常遭受的一種環(huán)境脅迫因子，它限制作物的產量，影響植物的自然分布［1-2］。剖析植物對低溫的應答反應機制、提高其抗低溫能力在農業(yè)生產上具有重要意義。為了適應和抵抗低溫脅迫，在長期進化過程中植物形成了相應的應答保護機制。目前，通過篩選和克隆的方法已得到了許多與冷馴化信號途徑相關的基因，例如 CBF、COR、KIN、RD 等［3］，對它們的功能分析為我們繪制了植物抗冷反應的信號傳遞網絡，其中ICE1-CBF-COR通路在植物的冷馴化過程中起重要作用。在冷馴化過程中，膜是最先受到低溫影響的細胞結構［4］;低溫誘導的質膜硬化可導致肌動蛋白細胞骨架的重排，誘導胞內Ca2+的瞬時增加［5］;IP3作為重要的信號分子介導細胞內鈣庫儲存的Ca2+釋放到胞質，從而調控CBF和COR基因的表達［6］。ICE1基因編碼一個MYB類型的堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉錄因子，在上游調節(jié)CBF和其他轉錄因子的表達，提高抗冷性［7］。HOS1蛋白通過泛素化介導的蛋白質降解負調控ICE1［8］。在不依賴于CBF的途徑中，轉錄因子 HOS9、HOS10、RNA修飾和核質轉運在調節(jié)有關抗冷基因的表達和提高植物抗冷能力方面具有至關重要的作用［9-10］。植物對冷脅迫的分子反應機制已經成為目前科學研究的熱門領域，近幾年的研究成果為改良作物的抗冷能力打下了堅實的基礎。

有研究結果表明，一些植物激素也參與了植物的抗逆反應過程。脫落酸(ABA)能夠提高低溫條件下植物的抗氧化能力，降低過氧化物(ROS)的積累［11］，誘導CBF基因的表達，但其表達量遠遠低于低溫誘導的表達量［12］。外施油菜素內酯(BR)在植物的生長發(fā)育過程中也具有重要的調節(jié)功能，例如參與光形態(tài)建成，促進植物細胞的生長、分裂和分化等。BR不僅能夠阻止低溫對葉綠體的破壞，提高植物的抗冷能力，還能夠恢復高鹽脅迫條件下幼苗的生長狀況［13］，但是BR在植物抗逆反應過程中所起作用的分子機制還不清楚。擬南芥的DWF4基因編碼一個類固醇類C22α-羥化酶，催化油菜素內酯的生物合成過程。該基因在植物活躍生長的組織中表達，例如根與莖的頂端組織以及根與莖的結合部位［14］，表達量受乙烯和茉莉酸甲酯的調控［15］，參與植物的抗高溫反應過程［16］，超表達DWF4的轉基因植株表現出外加BR的特征，包括較長的下胚軸等［17］。本試驗采用反向遺傳學的方法，利用擬南芥DWF4基因缺失突變體dwf4，研究敲除DWF4基因后擬南芥對低溫脅迫的響應，探討該基因在抗低溫脅迫反應過程中的功能。

1 材料與方法

1.1 植物材料和生長條件

試驗中所用的野生型擬南芥(Arabidopsis)和dwf4突變體均為Col-0生態(tài)型背景。在培養(yǎng)皿中無菌培養(yǎng)擬南芥，先對種子進行表面消毒，4℃同步化處理2～3 d后，均勻地種在含有0.8%瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基上，放在培養(yǎng)室中培養(yǎng)。培養(yǎng)室的培養(yǎng)條件:溫度為22℃，光照度為100 μmol/(m2·s)，光周期為16 h光照/8 h黑暗交替。低溫脅迫處理:在培養(yǎng)皿中生長21 d的材料不經冷馴化置于-20℃中1 h，4℃解凍12 h，于22℃、16 h光照/8 h黑暗中恢復7 d。

1.2 生理指標的測定

將在正常培養(yǎng)基上生長14 d的野生型擬南芥和dwf4突變體幼苗移到4℃條件下處理2 d，測定野生型擬南芥和dwf4突變體在低溫脅迫下可溶性糖和脯氨酸含量［18-19］。在營養(yǎng)土中生長21 d的野生型擬南芥和dwf4突變體幼苗，移到4℃條件下2 d進行低溫處理，測定葉綠素含量［20］。相對電滲透率的測定參考Ishitani等的方法［21］，其溫度處理過程為:初始溫度為0℃，在此溫度穩(wěn)定30 min后降至-1℃，-1℃維持1 h后加入碎冰，而后以2℃/h速度降溫至-12℃，每一個溫度梯度取1個樣。將在正常培養(yǎng)基上生長10 d的野生型擬南芥和dwf4突變體幼苗，移到4℃條件下進行低溫處理2 d，測定硫代巴比妥酸反應物(TBARS)的含量，測定方法參照文獻［22］、［23］。

1.3 實時熒光定量PCR

在正常培養(yǎng)基上生長10 d的野生型擬南芥和dwf4突變體幼苗，移到4℃條件下進行低溫處理，分別在0 h、12 h、24 h時取樣。用 TRIZOL試劑(Sigma，USA)提取總 RNA，用 AMV反轉錄酶(TaKaRa，Dalian)合成第一條 cDNA。利用 Agilent Strata-gene熒光定量PCR儀(Mx3005P)進行實時熒光定量PCR。熒光染料試劑盒采用SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa，日本)，以稀釋10倍的植物cNDA為模板。20 μl PCR反應體系中含1×SYBR Premix Ex Taq、上下游引物各 0.2 μmol/L、2 μl稀釋的 cDNA，使用UBQ10(Polyubiquitin 10)作為內參對目標基因進行相對定量。

2 結果

2.1 DWF4基因調節(jié)擬南芥對低溫脅迫的反應過程

DWF4(基因編號AT3g50660)位于擬南芥第3條染色體上，其中包含8個外顯子和7個內含子，編碼 513個氨基酸［14］。為了進一步探討DWF4的生物學功能，從擬南芥信息資源中心(The Arabidopsis Information Resource，TAIR)獲得DWF4基因的T-DNA插入突變體(SALK_020761)，其插入位置在第4個外顯子上。RTPCR結果顯示由于T-DNA的插入，DWF4基因被敲除(圖1)，將該突變體命名為dwf4。將在培養(yǎng)皿中正常生長21 d的野生型與dwf4突變體置于-20℃處理1 h，之后在4℃下解凍12 h，再置于正常培養(yǎng)條件下恢復生長7 d。我們發(fā)現dwf4突變體在受到低溫脅迫后能夠繼續(xù)生長出新的葉片，而野生型擬南芥在受到低溫脅迫后大多數葉片的葉綠素受到破壞而白化死亡(圖2)。低溫脅迫能夠導致植物的細胞受到傷害，造成相對電導率的變化。相對電導率能夠反映低溫脅迫對細胞膜的傷害程度，是細胞膜在逆境條件下生理活性高低的重要指標之一。相對電導率低，說明細胞膜的損傷程度小，進而細胞受到的傷害就小，抗寒能力就強。我們發(fā)現野生型和dwf4突變體經過低溫處理后其相對電導率都表現出增加的趨勢，但是dwf4突變體的相對電導率比野生型的低，例如，經過-9℃低溫處理，dwf4突變體的相對電導率為62%，而野生型的為75%(圖3)。植物中葉綠體對低溫脅迫相當敏感，低溫脅迫會造成葉綠素的降解。在正常條件下，dwf4突變體的葉綠素含量比野生型的稍低，但是經過低溫處理后野生型的葉綠素含量下降比較明顯，而dwf4突變體的葉綠素含量變化不大，導致dwf4突變體的葉綠素含量比野生型的還要高(圖4)，說明dwf4突變體抗冷能力強。

圖1 DWF4基因在野生型(WT)與dwf4突變體中的表達Fig.1 Expression of DWF4 gene in wild-type and dwf4 mutant plants

2.2 低溫脅迫下dwf4突變體可溶性糖和游離脯氨酸含量變化

圖2 野生型擬南芥和dwf4突變體在低溫處理前(左)和低溫處理后(右)的表型Fig.2 The phenotypes of wild-type and dwf4 mutant plants before(left)or after(right)cold stress

圖3 野生型擬南芥和dwf4突變體在不同低溫條件下的相對電導率Fig.3 Relative electronic conductivity of wild-type and dwf4 mutant plants induced by cold stress

圖4 低溫條件下野生型擬南芥和dwf4突變體的葉綠素含量Fig.4 Chlorophyll contents of wild-type and dwf4 mutant plants induced by cold stress

在逆境條件下，植物會積累一些滲透調節(jié)物質，例如可溶性糖和脯氨酸，用于平衡滲透壓對胞質的損傷，調節(jié)細胞膜的穩(wěn)定性，其含量的多少反映其抗逆能力的大?。?1，24］。因此，測定植物體在低溫脅迫條件下可溶性糖和脯氨酸的含量，在一定程度上可以判斷植物對低溫脅迫的抵抗能力。從圖5中可以看出，正常生長條件下dwf4突變體的可溶性糖與脯氨酸的含量都比野生型的高，分別是野生型的1.29與5.10倍。低溫處理后dwf4突變體和野生型的可溶性糖含量均有所提高，但此時dwf4突變體的可溶性糖與脯氨酸含量仍然比野生型的高，分別是野生型的1.32和6.40倍。低溫脅迫條件下，dwf4突變體中可溶性糖和脯氨酸的快速積累可能與相關的基因表達活躍有關。

圖5 野生型擬南芥和dwf4突變體在低溫脅迫下可溶性糖(A)和脯氨酸(B)含量Fig.5 Soluble sugar(A)and proline(B)contents of wild-type and dwf4 mutant plants induced by cold stress

2.3 DWF4負調控RD29A基因和COR47基因的表達

為了進一步探討dwf4突變體抗低溫脅迫的分子機制，選擇參與低溫脅迫反應的CBF轉錄因子與下游基因RD29A和COR47，對它們的表達量進行分析。實時熒光定量 PCR檢測結果表明，CBF1、CBF2、CBF3的表達量在低溫處理條件下升高，但在dwf4突變體與野生型中的表達量并沒有明顯區(qū)別(圖6)。RD29A的表達量在突變體和野生型中都受低溫脅迫的誘導，而且在突變體中的誘導表達量高，表達時間早。例如，在正常生長條件下，dwf4突變體中RD29A的表達量是野生型的1.22倍，在低溫處理12 h時，dwf4突變體中RD29A的表達量是野生型中的1.40倍。在低溫脅迫條件下dwf4突變體中COR47的表達量也高于野生型(圖7)，因此推測DWF4基因負調控RD29A和COR47的表達。

2.4 野生型和dwf4突變體中過氧化物酶基因的表達差異

圖6 野生型和dwf4突變體在低溫處理下CBF基因的表達量(以UBQ10作為內參)Fig.6 The expression levels of CBF gene of wild-type and dwf4 mutant plants induced by cold stress(UBQ10 internal control)

低溫脅迫能引起植物體內活性氧的積累，從而對細胞造成傷害，抑制生長［11］。硫代巴比妥酸反應物(TBARS)含量是測定植物體內脂質過氧化和自由基形成的一個重要指標。為了驗證低溫脅迫條件下dwf4突變體抗氧化能力的強弱，我們檢測了在不同條件下野生型和dwf4突變體中TBARS含量。結果表明，在正常生長條件下dwf4突變體中TBARS含量比野生型中的高，低溫脅迫能使擬南芥植株中TBARS含量升高，但dwf4突變體中TBARS含量仍高于野生型，即dwf4突變體中過氧化物的積累比野生型中的多(圖8)。但是，dwf4突變體抵抗低溫脅迫的能力卻比野生型強，為此我們用實時熒光定量PCR檢測了抗氧化防御系統(tǒng)相關基因表達水平的變化。過氧化物酶在清除植物體內過氧化物毒害方面起著重要作用，是植物抗氧化防御體系中的一個重要組成成分，參與抗逆反應。我們檢測了過氧化物酶基因Prx22(AT2g38380)和Prx69(AT5g64100)表達量的變化，發(fā)現在正常生長條件下，dwf4突變體中Prx22和Prx69的表達量就比野生型中的高(圖8)，這對低溫條件下dwf4突變體中高含量的過氧化物所產生的毒害起到了很好的抑制作用。

圖7 野生型和dwf4突變體在低溫處理下RD29A基因(A)和COR47基因(B)的表達量(以UBQ10作為內參)Fig.7 The expression levels of RD29A gene(A)and COR47 gene(B)of wild-type and dwf4 mutant plants induced by cold stress(UBQ10 as internal control)

圖8 野生型和dwf4突變體中低溫條件下的TBARS含量(A)以及過氧化物酶Prx22與Prx69表達量(B)(以UBQ10作為內參)Fig.8 TBARS content(A)and the expression levels of peroxidase genes Prx22 and Prx69(UBQ10 as internal control)(B)in wild-type and dwf4 mutant plants under cold stress

3 討論

在世界范圍內，低溫是一個重要的環(huán)境因子，影響植物的分布，限制作物的產量。低溫不僅能直接對細胞產生傷害導致植株的死亡，還可以造成氧化與滲透脅迫。為了克服這種限制因素提高農作物產量，研究植物抗冷反應分子機制，進而通過分子生物學手段提高農作物的抗冷能力，顯得至關重要。本研究中我們第一次發(fā)現敲除DWF4基因能夠提高擬南芥的抗冷能力。

擬南芥dwf4突變體中，油菜素內酯(BR)合成過程中的一個限速酶C22α-類固醇水解酶發(fā)生缺失突變，導致突變體內油菜素內酯含量減少［17］。dwf4突變體表現為極度矮化、葉片圓而短小卷曲、側根多且短、葉色深綠、下胚軸短且開花晚等特征。本試驗發(fā)現缺失突變體dwf4的抗冷能力明顯高于野生型。低溫脅迫條件下dwf4突變體中高含量的可溶性糖和脯氨酸降低了細胞水勢，有利于減少低溫條件下滲透脅迫對植物的損傷。特別是脯氨酸含量，在正常生長條件下，dwf4突變體中脯氨酸的含量就是野生型的6.4倍，這與Strizhov等［25］的發(fā)現一致。油菜素內酯能夠模擬黑暗對P5CS1-GUS表達的抑制，從而導致ABA處理或干旱脅迫下植株脯氨酸含量下降［25］，而dwf4突變體中油菜素內酯含量低而導致細胞中脯氨酸含量升高。BR是一種新型植物激素，在植物體內含量極低，但生理活性很高，不僅對植物的生長發(fā)育有影響，與植物抗性也有一定的關系，外用BR處理油菜和番茄植株可以增強它們的耐熱性［26］，還可以增強油菜和擬南芥的抗干旱和抗凍能力［27］。dwf4突變體體內油菜素內酯含量低而抗凍性強的分子機制可能與外施油菜素內酯后植株抗性增強的分子機制不同。Kagale等用BR處理擬南芥和油菜，發(fā)現CBF的表達量在擬南芥中只有微量變化，在油菜中根本沒有變化，下游的RD29A、COR47基因表達明顯高于對照［27］。我們也發(fā)現在低溫條件下dwf4突變體中CBF基因的表達量與野生型中的并沒有明顯區(qū)別，而RD29A和COR47的表達則高于野生型，說明BR對植物抗冷能力的調控可能不依賴CBF轉錄因子而是通過其他因子影響下游基因RD29A和COR47。許多非生物脅迫，例如干旱、高鹽、低溫等，都可以誘導過氧化物的產生，對植物體造成氧化脅迫，損傷DNA和蛋白質分子，抑制植物正常的生長和發(fā)育［28］。研究發(fā)現，盡管DWF4缺失導致突變體中過氧化物含量的增加，但是dwf4突變體中高表達的過氧化物酶Prx22與Prx698，對過氧化物的毒害起到了很好的抑制作用，這2個基因都屬于植物特有的過氧化物酶(Ⅲ)家族，我們推測該家族基因的高表達可能是dwf4突變體具有強抗冷能力的重要原因。同時，我們也注意到dwf4突變體的一些表型特征，例如下胚軸短、葉片圓而肥厚、葉色深綠等，一般在抗凍植物中多見，例如，過量表達CBF轉錄因子的植株［29］。野生型植株在低溫下生長數日到數月也會表現出矮化、葉色深綠并且葉片增厚的特征［18］，這也說明在正常生長條件下dwf4突變體中可能有抗冷相關基因的表達，我們的研究也證明在正常情況下dwf4突變體中RD29A基因的表達量就高于野生型。

［1］ 戴紅燕，華勁松，張榮萍，等.低溫脅迫對高原粳稻幼苗生長的影響［J］.江蘇農業(yè)科學，2014，42(11):85-88.

［2］ 李孝凱，沙 偉，國春暉，等.低溫脅迫對毛尖紫萼蘚、東亞砂蘚生理生化及光合特性的影響［J］.江蘇農業(yè)科學，2014，42(10):355-359.

［3］ THEOCHARIS A，CLEMENT C，BARKA E A.Physiological and molecular changes in plants grown at low temperatures［J］.Planta，2012，235(6):1091-1105.

［4］ SANGWAN V，ORVAR B L，BEYERLY J，et al.Opposite changes in membrane fluidity mimic cold and heat stress activation of distinct plant MAP kinase pathways［J］.Plant J，2002，31(5):629-638.

［5］ CATALA R，SANTOS E，ALONSO J M，et al.Mutations in the Ca2+/H+transporter CAX1increase CBF/DREB1 expression and the cold-acclimation response in Arabidopsis［J］.Plant Cell，2003，15(12):2940-2951.

［6］ CHINNUSAMY V，ZHU J K，ZHU J H.Gene regulation during cold stress acclimation in plants［J］.Physiologia Plantarum，2006，126(1):52-61.

［7］ CHINNUSAMY V，OHTA M，KANRAR S，et al.ICE1:a regulator of cold-induced transcriptome and freezing tolerance in Arabidopsis［J］.Genes Dev，2003，17(8):1043-1054.

［8］ ZHU J，DONG C H，ZHU J K.Interplay between cold-responsive gene regulation，metabolism and RNA processing during plant cold acclimation［J］.Curr Opin Plant Biol，2007，10(3):290-295.

［9］ ZHU J，SHI H，LEE B H，et al.An Arabidopsis homeodomain transcription factor gene，HOS9，mediates cold tolerance through a CBF2-independent pathway［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(26):9873-9878.

［10］ DONG C H，HU X，TANG W，et al.A putative Arabidopsis nucleoporin，AtNUP160，is critical for RNA export and required for plant tolerance to cold stress［J］.Mol Cell Biol，2006，26(24):9533-9543.

［11］ LIU Y，JIANG H，ZHAO Z，et al.Abscisic acid is involved in brassinosteroids-induced chilling tolerance in the suspension cultured cells from Chorispora bungeana［J］.J Plant Physiol，2011，168(9):853-862.

［12］ KNIGHT H，ZARKA D G，OKAMOTO H，et al.Abscisic acid induces CBF gene transcription and subsequent induction of coldregulated genes via the CRT promoter element［J］.Plant Physiol，2004，135(3):1710-1717.

［13］ ANURADHA R，RAO S S R.Effects of brassinosteroids on salinity stress induced inhibition of seed germination and seedling growth of rice(Oryza sativa L.)［J］.Plant Growth Regul，2001，33(2):151-153.

［14］ KIM H B，KWON M，RYU H，et al.The regulation of DWARF4 expression is likely a critical mechanism in maintaining the homeostasis of bioactive brassinosteroids in Arabidopsis［J］.Plant Physiol，2006，140(2):548-557.

［15］ CHUNG Y，MAHARJAN P M，Lee O，et al.Auxin stimulates DWARF4 expression and brassinosteroid biosynthesis in Arabidopsis［J］.Plant J，2011，66(4):564-578.

［16］ MAHARJAN P M，CHOE S.High temperature stimulates DWARF4(DWF4)expression to increase hypocotyl elongation in Arabidopsis［J］.J Plant Biol，2011，54(6):425-429.

［17］ CHOE S，FUJIOKA S，NOGUCHI T，et al.Overexpression of DWARF4 in the brassinosteroid biosynthetic pathway results in increased vegetative growth and seed yield in Arabidopsis［J］.Plant J，2001，26(6):573-582.

［18］ RISTIC Z，ASHWORTH E N.Ultrastructural evidence thatintracellular ice formation and possibly cavitation are the sources of freezing injury in supercooling wood tissue of Cornus florida L.［J］.Plant Physiol，1993，103(3):753-761.

［19］ SHI H T，YE T T，CHEN F F，et al.Manipulation of arginase expression modulate abiotic stress tolerance in Arabidopsis:effent on arginine metabolism and ROS accumulation［J］.J Exp Bot，2013，64(5):1367-1397.

［20］ LICHTENTHALER H K.Chlorophyll and carotenoids:pigments of photosynthetic biomembranes［J］.Methods Enzymol，1987，148:350-382.

［21］ ISHITANI M，XIONG L，LEE H，et al.HOS1，a genetic locus involved in cold-responsive gene expression in Arabidopsis［J］.Plant Cell，1998，10(7):1151-1161.

［22］ HAN Y，ZHANG J，CHEN X，et al.Carbon monoxide alleviates cadmium-induced oxidative damage by modulating glutathione metabolism in the roots of Medicago sativa［J］.New Phytol，2008，177(1):155-166.

［23］ XIE Y，LING T，HAN Y，et al.Carbon monoxide enhances salt tolerance by nitric oxide-mediated maintenance of ion homeostasis and up-regulation of antioxidant defence in wheat seedling roots［J］.Plant Cell Environ，2008，31(12):1864-1881.

［24］ LV W T，LIN B，ZHANG M，et al.Proline accumulation is inhibitory to Arabidopsis seedlings during heat stress［J］.Plant Physiol，2011，156(8):1921-1933.

［25］ STRIZHOV N，áBRAHáM E，?KRéSZ L，et al.Differential expression of two P5CS genes controlling proline accumulation during salt-stress requires ABA and is regulated by ABA1，ABI1 and AXR2 in Arabidopsis［J］.The Plant Journal，1997，12(3):557-569.

［26］ DHAUBHADEL S，CHAUDHARY S，DOBINSON K F，et al.Treatment with 24-epibrassinolide，a brassinosteroid，increases the basic thermotolerance of Brassica napus and tomato seedlings［J］.Plant Mol Biol，1999，40(2):333-342.

［27］ KAGALE S，DIVI U K，KROCHKO J E，et al.Brassinosteroid confers tolerance in Arabidopsis thaliana and Brassica napus to a range of abiotic stresses［J］.Planta，2007，225(2):353-364.

［28］ ASADA K.Production and scavenging of reactive oxygen species in chloroplasts and their functions［J］.Plant Physiol，2006，141(2):391-396.

［29］ STOCKINGER E J，GILMOUR S J，THOMASHOW M F.Arabidopsis thaliana CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional activator that binds to the C-repeat/DRE，a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94(3):1035-1040.