董秀山，賀杰峰，趙浩亮(山西大醫(yī)院普通外科，太原 030032;通訊作者，E-mail:haoliangzhao@hotmail．com)

肝再生是臨床各種急慢性肝病和肝臟外科手術(shù)后重要的病理生理過程。維持正常的肝再生是修復肝損傷的必然機制，肝再生失調(diào)和重型肝炎、肝硬化以及肝癌等疾病的發(fā)生發(fā)展密不可分。因此，深入分析和闡述肝再生調(diào)控及影響機制，對治療臨床肝病具有非常重要的意義。前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠腸道膽汁酸缺乏使再生肝細胞的增殖細胞核抗原PCNA、Ki-67表達顯著下降，并伴隨血清總膽汁酸水平的下降和膽汁酸合成限速酶(CYP7A1)mRNA表達的升高［1］。提示膽汁酸是維持正常肝再生的重要內(nèi)源性物質(zhì)，CYP7A1的表達升高抑或為在肝再生過程中對機體缺乏膽汁酸的反應性調(diào)節(jié)。在此基礎上，本實驗重點觀察在肝再生過程中，腸道缺乏膽汁酸對肝細胞基膜側(cè)膽鹽攝取系統(tǒng)Na+依賴牛磺膽酸鈉協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白(NTCP)以及細胞周期蛋白D1(cyclin D1)表達的影響。

1 材料與方法

1．1 動物分組及模型建立

清潔級雄性Wistar大鼠72只(山西醫(yī)科大學動物實驗中心)，體重200-280 g，隨機分為3組。腸道膽酸缺乏組于術(shù)前7 d飼喂含2%無水考來烯胺飼料;膽酸負荷組于術(shù)前7 d飼喂含0．2%膽酸飼料;對照組飼喂標準飼料，每組根據(jù)處死模型大鼠的時間不同即6 h，12 h和24 h又分為三小組，每小組大鼠8只。所有大鼠均在乙醚麻醉下行70%(肝左葉+肝中葉)肝部分切除術(shù)(partial hepatectomy，PH)，建立肝再生大鼠動物模型。術(shù)后根據(jù)分組繼續(xù)給予相應飼料喂養(yǎng)，分別于6 h，12 h和24 h乙醚麻醉處死大鼠，收集肝臟標本于-80℃保存。

1．2 主要試劑和儀器

膽酸鈉(C24H40O5，408．58)，美國 Sigma 公司;無水考來烯胺，南京厚生藥業(yè)有限公司;兔抗NTCP抗體，美國ADL公司;兔抗大鼠cyclin D1抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司;BCA試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG，碧云天生物技術(shù)研究所;超聲粉碎儀，上海楚定分析儀器有限公司;低溫離心機，美國Beckman-Coulter公司;Tanon-2500凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司。

1．3 Western blot檢測cyclin D1和NTCP蛋白表達

按試劑操作說明書提取蛋白質(zhì)，整個過程盡量在冰上進行。為了保證上樣量的均衡，用BCA試劑盒測定蛋白含量，然后加入適量樣品和Buffer在90℃變性20 min。取各組制備的蛋白樣品用10%SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，并用麗春紅染色檢測轉(zhuǎn)移效果。封閉液37℃下孵育1 h，分別加兔抗大鼠cyclin D1抗體(1∶500)和兔抗NTCP抗體(1∶400)，4℃封閉過夜。TBST沖洗，滴加辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(1∶5 000)孵育1 h，TBST沖洗，化學發(fā)光法顯色，洗片。凝膠成像分析系統(tǒng)分析條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計算各組相應的灰度值比值。

1．4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2．1 大鼠肝細胞cyclin D1蛋白表達的比較

通過比較三組大鼠在70%肝部分切除術(shù)后6 h cyclin D1相對表達量，發(fā)現(xiàn)膽酸缺乏組大鼠肝組織的表達量顯著低于對照組(P＜0．05)，而膽酸負荷組顯著高于對照組(P＜0．05)和膽酸缺乏組(P＜0．01)(見圖1)。在術(shù)后12 h時，膽酸缺乏組和對照組無統(tǒng)計學差異，但顯著低于負荷組(P＜0．05，見圖2)。

圖1 三組大鼠PH后6 h肝組織cyclin D1蛋白表達Figure 1 Expression of cyclin D1 protein in liver tissues at 6h after the operation

圖2 三組大鼠PH后12 h肝組織cyclin D1蛋白表達Figure 2 Expression of cyclin D1 protein in liver tissues at 12 h after the operation

2．2 肝部分切除術(shù)后24 h NTCP蛋白表達

前期研究顯示在術(shù)后24 h大鼠血清總膽汁酸和肝再生情況變化最為顯著。因此，檢測術(shù)后24 h肝細胞基膜側(cè)膽鹽攝取系統(tǒng)Na+依賴?；悄懰徕c協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白(NTCP)對肝再生時評估肝細胞對膽汁酸重吸收能力更具有意義。蛋白圖像分析的數(shù)據(jù)顯示(圖3)，膽酸缺乏組的NTCP蛋白相對表達量最高，膽酸負荷組NTCP的表達量最低，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。

圖3 三組大鼠PH后24 h肝組織NTCP蛋白表達Figure 3 Expression of NTCP in liver tissues at 24 h after the operation

3 討論

一般認為，膽汁酸對脂類和脂溶性物質(zhì)的消化吸收以及調(diào)節(jié)膽固醇代謝發(fā)揮著重要作用。然而，1999年膽汁酸受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)的發(fā)現(xiàn)使人們開始重新認識膽汁酸的生理作用，即膽汁酸在糖、脂和能量代謝等方面發(fā)揮著重要作用［2-4］。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)適當增加體內(nèi)膽汁酸含量顯著促進大鼠肝部分切除術(shù)(PH)后肝細胞DNA合成，反之則顯著抑制，且伴有肝細胞DNA合成的高峰延遲［1］。本實驗數(shù)據(jù)顯示70%PH后6 h，肝組織cyclin D1蛋白表達由高到低依次為膽酸負荷組、對照組和膽酸缺乏組(P＜0．05);70%PH后12 h，膽酸缺乏組和對照組的肝組織cyclin D1蛋白表達無統(tǒng)計學差異，但顯著低于膽酸負荷組(P＜0．05)，這些結(jié)果進一步說明膽汁酸在肝再生過程中發(fā)揮著重要作用。

究其機制，在過去10多年中，大量關(guān)于FXR功能的研究已經(jīng)證實FXR是一種關(guān)鍵的代謝調(diào)節(jié)劑，主要調(diào)節(jié)膽汁酸內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、脂蛋白和葡萄糖代謝，認為FXR可能充當著代謝壓力的一般感應器和調(diào)節(jié)特定群組基因表達的調(diào)節(jié)器的角色從而達到保護肝臟的目的［5］。因此，膽汁酸作為肝臟的重要代謝產(chǎn)物，目前的研究結(jié)果不能完全詮釋膽汁酸調(diào)節(jié)肝再生的機制，其機制仍需進一步深入研究。

肝細胞是高度極性化的上皮細胞，肝細胞極性是肝臟獨特生理功能的基礎，是研究正常肝臟生理功能及肝再生過程中重要的物質(zhì)結(jié)構(gòu)。肝細胞極性主要由生理功能不同的基底側(cè)膜(血竇側(cè))、頂端膜(膽管側(cè))和側(cè)面膜構(gòu)成。在肝再生過程中，肝細胞基膜側(cè)膽鹽攝取系統(tǒng)Na+依賴牛磺膽酸鈉協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白(NTCP)對調(diào)節(jié)肝細胞內(nèi)膽汁酸發(fā)揮著重要作用［6］。本課題通過檢測PH后24 h肝組織NTCP蛋白表達，顯示膽酸缺乏組的NTCP蛋白相對表達量最高，而膽酸負荷組NTCP的表達量最低。這些可能是在肝再生過程中，體內(nèi)對肝細胞缺乏膽汁酸的一種自我調(diào)節(jié)，通過上調(diào)NTCP來增加肝細胞內(nèi)膽汁酸的含量。

事實上，再生肝細胞極性重建不是細胞增殖的后續(xù)效應，而是肝再生過程中不可分割的一部分。2011年Fu等［7］研究發(fā)現(xiàn)膽汁酸在肝細胞極性形成中發(fā)揮著一個新的重要作用，添加牛磺膽酸鈉促進大鼠肝細胞極性形成，提示膽汁酸可能是肝細胞極性紊亂的潛在治療物質(zhì)。因此，進一步觀察膽汁酸和肝細胞極性形成的相互關(guān)系可能為研究肝再生和膽汁淤積肝病提供新思路。

［1］Dong X，Zhao H，Ma X，et al．Reduction in bile acid pool causes delayed liver regeneration accompanied by down-regulated expression of FXR and C-Jun mRNA in rats［J］．J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2010，30(1):55-60．

［2］Parks DJ，Blanchard SG，Bledsoe RK，et al．Bile acids:natural ligands for an orphan nuclear receptor［J］．Science，1999，284(5418):1365-1368．

［3］Makishima M，Okamoto AY，Repa JJ，et al．Identification of a nuclear receptor for bile acids［J］．Science，1999，284(5418):1362-1365．

［4］Wang H，Chen J，Hollister K，et al．Endogenous bile acids are ligands for the nuclear receptor FXR/BAR［J］．Mol Cell，1999，3(5):543-553．

［5］Li T，Jahan A，Chiang JY．Bile acids and cytokines inhibit the human cholesterol 7 alpha-hydroxylase gene via the JNK/c-jun pathway in human liver cells［J］．Hepatology，2006，43(6):1202-1210．

［6］Attakpa ES，Djibril NM，Baba-Moussa F，et al．Expression and role of the genes involved in the transport of bile acids in the liver and kidneys in mice［J］．J Basic Clin Physiol Pharmacol，2013，24(2):97-103．

［7］Fu D，Wakabayashi Y，Lippincott-Schwartz J，et al．Bile acid stimulates hepatocyte polarization through a cAMP-Epac-MEK-LKB1-AMPK pathway［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108(4):1403-1408．