崔 佳，萬翠香(長治醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，長治 046000;南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;通訊作者，E-mail:cuixiangwan@ncu．edu．cn)

插入突變是研究功能基因組學(xué)的一種重要方法，可為確定基因的功能提供最直接的證據(jù)［1］。本文應(yīng)用的是質(zhì)粒介導(dǎo)的插入突變，它是研究微生物功能基因組學(xué)的一種常用方法，其原理是將不能自主復(fù)制的自殺性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主，與宿主基因進(jìn)行同源重組，達(dá)到對特定基因的改造或失活，進(jìn)而開展基因功能的研究［2，3］。

自2006年雀巢公司發(fā)現(xiàn)在雙歧桿菌NCC2705中存在絲氨酸蛋白酶抑制劑Serpin(serine protease inhibitor)以來，先后在短雙歧桿菌210B中也發(fā)現(xiàn)Serpin蛋白［4］，然而關(guān)于Serpin蛋白在原核生物特別是在雙歧桿菌中的功能鮮見研究報(bào)道［5-7］。在本實(shí)驗(yàn)室前期工作中，葉若松等［8］通過PCR擴(kuò)增和Southern印跡雜交的方法發(fā)現(xiàn)B．bifidum WBBI02中存在serpin，將其連接入克隆載體pMD18-T和表達(dá)載體pET22b(+)，使serpin在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，且進(jìn)行了體外黏附功能研究。本實(shí)驗(yàn)利用前期構(gòu)建的質(zhì)粒pMD18-T/serpin在serpin基因片段的SacⅡ酶切位點(diǎn)插入氯霉素抗性基因cmr，構(gòu)建出雙歧桿菌pMD18-T/serpin-cmr插入失活質(zhì)粒，為后續(xù)篩選雙歧桿菌serpin突變株逆向研究serpin功能做準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1．1 菌株與質(zhì)粒

菌株:E．coli．DH5α(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏)。質(zhì)粒:pMD18-T/serpin質(zhì)粒(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建);pNZ44質(zhì)粒(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏)

1．2 主要試劑與儀器

SacⅡ內(nèi)切酶、CIAP去磷酸化酶均購自于TaKa-Ra大連寶生物有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒購自于北京全式金生物技術(shù)有限公司;PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自于北京賽百盛基因技術(shù)有限公司;PCR儀:德國Eppendorf公司;離心機(jī):德國Thermo公司;凝膠成像系統(tǒng):美國Bio-Rad公司。

1．3 提取pMD18-T/serpin和pNZ44質(zhì)粒，克隆氯霉素抗性基因cmr

采用EasyPure Plasmid MiniPrep Kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司)提取pMD18-T/serpin和pNZ44質(zhì)粒。根據(jù)已發(fā)表的氯霉素抗性基因序列，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)cmr基因引物，上游引物:GCCGCGGATGAACTTTAATAAAATTGATTTAGAC(SacⅡ)和下游引物:GCCGCGGTTTTATAAAAGCCAGTCATTAG(SacⅡ)，對提取的pNZ44質(zhì)粒的cmr基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用1．0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并采用北京賽百盛基因技術(shù)有限公司的PCR產(chǎn)物純化試劑盒，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化。

1．4 單酶切pMD18-T/serpin和cmr，連接后篩選重組質(zhì)粒pMD18-T/serpin-cmr

用SacⅡ?qū)|(zhì)粒pMD18-T/serpin進(jìn)行單酶切，得到開環(huán)質(zhì)粒，為防止質(zhì)粒本身自連，單酶切后的質(zhì)粒進(jìn)行去磷酸化反應(yīng)，將5＇-P轉(zhuǎn)化為5＇-OH，再按照去磷酸化體系∶樹脂=1∶1對去磷酸化后的質(zhì)?；厥?。同時將PCR擴(kuò)增到的cmr產(chǎn)物也經(jīng)SacⅡ酶切，酶切后回收并與pMD18-T-serpin載體進(jìn)行連接，將連接體系轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證初步挑選出陽性克隆，再提取重組質(zhì)粒pMD18-T/serpin-cmr，用SacⅡ作酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的質(zhì)粒送往南京金斯瑞公司測序。

2 結(jié)果

2．1 pMD18-T/serpin質(zhì)粒的提取和cmr的擴(kuò)增結(jié)果

pMD18-T/serpin質(zhì)粒提取后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后結(jié)果見圖1A;cmr擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后結(jié)果見圖1B;在750 bp左右可見目的基因片段，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 pMD18-T/serpin質(zhì)粒提取和PCR擴(kuò)增cmr電泳圖譜Figure 1 Electrophoresis of the plasmids extraction of pMD18-T-serpin and PCR amplification of cmr

2．2 載體pMD18-T/serpin酶切去磷酸化后回收檢測

為了避免pMD18-T/serpin酶切后自連，將酶切回收后的pMD18-T/serpin磷酸化處理，0．5 h后樹脂回收去磷酸化產(chǎn)物，電泳檢測回收產(chǎn)物，結(jié)果顯示，在約3 000-4 000 bp之間可見目的基因條帶(見圖2)，與預(yù)期結(jié)果一致。

圖2 去磷酸化后回收電泳圖譜Figure 2 Electrophoresis of dephosphorylated products

2．3 菌落PCR驗(yàn)證陽性克隆子

挑取轉(zhuǎn)化平板上的單菌落用cmr引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示，篩選的3個克隆在750 bp附近都擴(kuò)增出了條帶(見圖3)，與目的基因cmr的片段長度相符合，電泳結(jié)果初步判定篩選到的菌落為陽性克隆。

圖3 菌落PCR電泳圖譜Figure 3 Electrophoresis of colony PCR

2．4 酶切驗(yàn)證陽性克隆

菌落PCR驗(yàn)證顯陽性的克隆再進(jìn)行SacⅡ酶切驗(yàn)證，電泳結(jié)果(圖4)顯示，1號泳道的克隆酶切到cmr基因，而2號泳道的克隆酶切驗(yàn)證陰性。將1號泳道的陽性重組質(zhì)粒測序，序列分析表明:克隆獲得的cmr基因片段為768 bp(見圖4)，與 GenBank中序列完全一致。

圖4 pMD18-T/serpin-cmr酶切鑒定電泳圖Figure 4 Electrophoresisofrecombinantplasmid pMD18-T/serpin-cmr digested by enzymes

3 討論

抗生素的廣泛使用，使得雙歧桿菌的抗藥性越來越多樣化。易發(fā)平等［9］研究報(bào)道，兩歧雙歧桿菌對氨基糖苷類和黃胺類抗生素具有抗性，而對氨芐類和氯霉素類抗生素敏感。而康小紅等［10］的研究顯示，雙歧桿菌對青霉素類、喹諾酮類抗生素也具有抗性，而對氯霉素類敏感。石晶紅［11］在對12株雙歧桿菌的藥敏性研究中發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌對氯霉素類抗生素敏感。因此，我們選擇以氯霉素類抗生素為標(biāo)記構(gòu)建插入失活載體，作為突變株的篩選標(biāo)記。

功能基因組研究的一個重要內(nèi)容是突變體的構(gòu)建，這是因?yàn)橥蛔凅w和相應(yīng)的突變基因間有著直接的因果關(guān)系［12］，構(gòu)建突變體庫的方法有物理和化學(xué)誘變、基因沉默、基因敲除以及插入突變等。插入突變與其他方法相比具有很多優(yōu)點(diǎn)，該方法利用已知的插入序列作為標(biāo)記基因，直接可對未知基因進(jìn)行反向研究，不必事先確定基因表達(dá)和基因產(chǎn)物［1，13］，且插入突變具有操作簡便、快捷的特點(diǎn)。因此，在功能基因組學(xué)研究中插入突變已成為基因初步鑒定及功能研究的首選方法［14，15］。利用插入突變進(jìn)行功能基因組學(xué)研究時主要采用T-DNA、轉(zhuǎn)座子及質(zhì)粒介導(dǎo)的插入突變等方法構(gòu)建突變庫［16］，本研究即采用質(zhì)粒介導(dǎo)的插入突變方法試圖對長雙歧桿菌中Serpin進(jìn)行功能失活的研究。實(shí)驗(yàn)中我們成功構(gòu)建了雙歧桿菌serpin基因的插入失活載體pMD18-T/serpin-cmr，為后續(xù)通過同源重組獲得serpin突變株提供了打靶載體，進(jìn)而對逆向探究雙歧桿菌Serpin蛋白的黏附功能改變奠定了工作基礎(chǔ)［17-19］。

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