涂宗財(cái)，余 莉，黃小琴

動(dòng)態(tài)高壓微射流對牛血清白蛋白糖基化反應(yīng)的影響

涂宗財(cái)，余 莉，黃小琴

（江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330022）

以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）-葡萄糖為研究對象，通過比色法、差示掃描量熱儀、紅外光譜及圓二色譜研究動(dòng)態(tài)高壓微射流（dynamic high pressure microfluidization，DHPM）不同處理壓力（40、80、120、160 MPa）對BSA-葡萄糖干熱糖基化反應(yīng)產(chǎn)物性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明：BSA-葡萄糖經(jīng)DHPM處理后，其糖基化產(chǎn)物游離氨基含量明顯減少，且隨著壓力的增加先減少后增加；經(jīng)差示掃描量熱儀分析得出其熱穩(wěn)定性隨處理壓力增大先升高后降低；紅外光譜和圓二色譜分析表明，BSA-葡萄糖經(jīng)DHPM預(yù)處理后，糖基化產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。這些結(jié)果說明DHPM促進(jìn)了BSA-葡萄糖體系的糖基化反應(yīng)。

牛血清白蛋白；動(dòng)態(tài)高壓微射流；糖基化；結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的糖基化反應(yīng)是指親水性的糖類物質(zhì)以共價(jià)鍵接入食品蛋白質(zhì)分子中，使糖基化產(chǎn)物既具有蛋白質(zhì)的大分子特性，又具有糖類物質(zhì)的親水特性。影響蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)的因素很多，包括內(nèi)在反應(yīng)條件，如溫度、反應(yīng)時(shí)間、水分活度和反應(yīng)物的性質(zhì)等[1]；超高壓、超聲波、微波和脈沖電場等外場輔助法也都有助于促進(jìn)糖基化反應(yīng)的進(jìn)行。Schwarzenbolz等[2]研究發(fā)現(xiàn)600 MPa的高靜壓可以影響酪蛋白或氨基酸與糖的糖基化反應(yīng)，減少某些副產(chǎn)物的產(chǎn)生；Guan Junjun等[3]采用微波加熱大豆蛋白-糖溶液體系，發(fā)現(xiàn)微波加熱明顯加快大豆蛋白-糖共聚物的形成；Shi Wenhui等[4]發(fā)現(xiàn)牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）與葡萄糖溶液體系的美拉德反應(yīng)程度隨著超聲強(qiáng)度的增大而提高，從而改變蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，并提高其抗氧化活性；Guan Yongguang等[5]研究發(fā)現(xiàn)脈沖電場可以促進(jìn)BSA-葡聚糖溶液體系的糖基化反應(yīng)。

動(dòng)態(tài)高壓微射流技術(shù)（dynamic high pressure microfluidization，DHPM）是集輸送、混合、超微粉碎、加壓、膨化等多種單元操作于一體的一門全新技術(shù)[6]。DHPM可以有效改善蛋白質(zhì)、淀粉、膳食纖維等的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)，是一種前景很好的食品生物大分子改性技術(shù)[7]。目前關(guān)于DHPM對蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)的影響相關(guān)研究少見報(bào)道。BSA作為一種常用的模式蛋白，也是牛奶中乳清蛋白的一種組成成分[8]，以其為原料研究美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的功能特性，可以作為動(dòng)物來源的代表性蛋白，對其他動(dòng)物蛋白的糖基化改性可提供理論參考[9]。本課題組前期采用DHPM與糖基化反應(yīng)相結(jié)合改性蛋白質(zhì)，研究 發(fā)現(xiàn)DHPM預(yù)處理誘導(dǎo)BSA的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而促進(jìn)BSA的糖基化反應(yīng)，提高BSA的糖基化程度并增加其糖基化位點(diǎn)[10]。DHPM誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)去折疊進(jìn)而促進(jìn)蛋白質(zhì)的糖基化反應(yīng)，表明DHPM為食品加工過程中糖基化反應(yīng)的促進(jìn)提供了一種有效方法。因此，本實(shí)驗(yàn)室在前期研究的基礎(chǔ)上，以BSA-葡萄糖體系為研究對象，研究DHPM對反應(yīng)體系游離氨基、熱穩(wěn)定性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，為DHPM在蛋白質(zhì)-糖類反應(yīng)體系中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

牛血清白蛋白（BSA）上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司。

鄰苯二甲醛（o-phthalic dicarboxaldehyde，OPA）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）、β-巰基乙醇美國Sigma公司；葡萄糖、磷酸鹽緩沖液、甲醇等均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

M-110EH微射流均質(zhì)機(jī)美國Microfluidics公司；MOS-450/AF-CD圓二色譜儀法國Bio-Logic SAS公司；UV-3200型紫外-可 見分光光度計(jì)上海美譜達(dá)儀器有限公司；Nicolet 6700紅外光譜儀美國熱電尼高利儀器有限公司；DSC 200 F3差示掃描量熱儀德國耐馳儀器制造有限公司。

1.3方法

1.3.1樣品制備

將BSA溶于蒸餾水中配成10 mg/mL的溶液，BSA溶液與葡萄糖按質(zhì)量比1∶1混合后，采用DHPM均質(zhì)機(jī)在0、40、80、120、160 MPa條件下分別處理3次，冷凍干燥，然后根據(jù)Ledesma[11]和Li Zheng[12]等的方法稍作修改，樣品在55℃條件下干熱反應(yīng)20 h，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫脴悠贩謩e表示為BSA、BSAG（BSA-葡萄糖）、BSAG40（BSA-葡萄糖經(jīng)DHPM 40 MPa處理）、BSAG80（BSA-葡萄糖經(jīng)DHPM 80 MPa處理）、BSAG120（BSA-葡萄糖經(jīng)DHPM 120 MPa處理）、BSAG160（BSA-葡萄糖經(jīng)DHPM 160 MPa處理）。

1.3.2游離氨基含量的測定

準(zhǔn)確稱取80 mg的OPA溶解于2 mL甲醇中，再加入20 g/100 mL SDS 5 mL，0.1 mol/L的硼砂50 mL及200μLβ-巰基乙醇，最后用蒸餾水定容到100 mL。測定時(shí)，配制0.5 mg/mL的樣品溶液，取4.0 mL OPA試劑于試管中，加入200μL樣品，混合均勻，放入35℃水浴中反應(yīng)2 min后在340 nm波長處測定吸光度（A340nm），另取4.0 mL OPA試劑于試管中，加入200μL水作為空白對照。用相同的方法，以賴氨酸代替樣品做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)曲線計(jì)算樣品中游離氨基的含量[13]。

1.3.3熱穩(wěn)定性

采用差示掃描量熱儀的方法測定糖基化產(chǎn)物的變性溫度，用樣品鋁盒稱取6.0 mg左右的樣品（精確到0.1 mg）。掃描溫度范圍為30～120℃，掃描速率為10℃/min。空盤作參比，記錄峰值溫度[14]。

1.3.4紅外光譜測定

準(zhǔn)確稱量2 mg的樣品，加入一定量的溴化鉀至200 mg，用研缽研磨成均勻粉末，壓制成薄片，再用紅外光譜儀做全波段掃描（4 000～400 cm-1），掃描次數(shù)32次[15]。

1.3.5圓二色譜分析

根據(jù)Choi等[16]的方法，將樣品采用10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0）配制成質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL的溶液，用1 mm的比色皿裝樣，置于圓二色譜儀測定。檢測波長：190～250 nm，掃描速率：50 nm/min，寬度：1.0 nm，圓二色譜數(shù)據(jù)用平均橢圓率表示。采用圓二色譜分析網(wǎng)站計(jì)算不同二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

1.4數(shù)據(jù)處理

樣品測定均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 8.0處理并用SPSS 20.0軟件進(jìn)行顯著性差異分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1游離氨基含量測定結(jié)果

圖1 DHPM不同壓力對BSA-葡萄糖體系游離氨基含量的影響Fig.1 Effect of DHPM at various pressures on the free amino group content of BSA-glucose system

由圖1可知，BSA經(jīng)葡萄糖糖基化后游離氨基含量明顯減少，與文獻(xiàn)[9]結(jié)果相同。經(jīng)DHPM均質(zhì)處理后，BSA糖基化產(chǎn)物游離氨基含量隨著壓力的增加先減少后增加，在120 MPa時(shí)游離氨基含量最低，說明DHPM促進(jìn)了BSA糖基化反應(yīng)，這可能是因?yàn)閴毫φT導(dǎo)BSA構(gòu)象發(fā)生變化，使其結(jié)構(gòu)變得更為分散，糖基化反應(yīng)位點(diǎn)增多，使得美拉德反應(yīng)更加充分，游離氨基含量更少，當(dāng)DHPM壓力低于某個(gè)值時(shí)，蛋白質(zhì)趨于去折疊狀態(tài)，當(dāng)壓力繼續(xù)升高，達(dá)到更大的值后，蛋白質(zhì)將會(huì)聚集，使得糖基化產(chǎn)物的游離氨基含量又有所增加，這與Huang Xiaoqin等[10]研究結(jié)果相同。

圖2 DHPM不同壓力對BSA-葡萄糖體系熱穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of DHPM at various pressures on the thermal stability of BSA-glucose system

2.2熱穩(wěn)定性測定結(jié)果

由圖2可知，原樣BSA的熱變性溫度最低，經(jīng)糖基化后明顯提高，變性溫度達(dá)到104.1℃，與文獻(xiàn)[17-18]

報(bào)道相同。經(jīng)DHPM均質(zhì)處理后，BSA糖基化產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性降低，隨著處理壓力的增大，熱穩(wěn)定性呈升高趨勢，這是因?yàn)镈HPM使BSA的構(gòu)象發(fā)生變化，結(jié)構(gòu)更為松散，部分相互作用力遭到破壞[19-20]，說明DHPM降低了BSA的熱穩(wěn)定性，但糖基化又使得BSA的熱穩(wěn)定性明顯提高，糖基化增強(qiáng)BSA熱穩(wěn)定性比DHPM降低BSA

熱穩(wěn)定性要顯著，所以BSA糖基化產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性隨著DHPM壓力的增大而增大，且都高于原樣，低于未經(jīng)DHPM處理的糖基化產(chǎn)物。

2.3紅外光譜分析

圖3 DHPM不同壓力下BSA-葡萄糖體系的紅外光譜Fig.3 Infrared spectra of BSA-glucose system after DHPM at various pressures

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和糖共價(jià)結(jié)合后，在紅外圖譜上的典型特征是在1 360～1 250 cm-1范圍內(nèi)和在1 260～1 000 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)吸收，這分別是C—N和C—O的伸縮振動(dòng)引起的[21]。由圖3可知，BSA經(jīng)糖基化后紅外圖譜在1 360～1 250 cm-1范圍內(nèi)相對吸收增強(qiáng)，表明產(chǎn)物分子中新形成了C—N共價(jià)鍵[22]，在1 260～1 000 cm-1范圍內(nèi)峰的吸收強(qiáng)度明顯大于原蛋白，是因?yàn)槠咸烟堑慕尤?，引入了更多的C—O，使得對應(yīng)吸收峰相對強(qiáng)度增大。1 500～1 350 cm-1波段的吸收峰強(qiáng)度增加，這說明接枝反應(yīng)能引起C—H的彎曲振動(dòng)及C—OH彎曲振動(dòng)的增加。經(jīng)DHPM處理的BSA糖基化產(chǎn)物的吸收峰隨壓力不同而發(fā)生不同程度的變化，有略微的紅移或藍(lán)移，峰位和峰面積有所變化，與文獻(xiàn)[20]報(bào)道相同。

2.4圓二色譜分析

圖4 DHPM不同壓力下BSA-葡萄糖體系的圓二色譜圖Fig.4 CD of BSA-glucose system after DHPM at various pressures

由圖4可知，糖基化后BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞，192、208 nm和222 nm的吸收較原蛋白明顯減弱，表明產(chǎn)物中α-螺旋結(jié)構(gòu)顯著減少[23]，說明蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化。由表1可知，BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋，沒有β-折疊，與文獻(xiàn)[24]報(bào)道相同，經(jīng)糖基化后，α-螺旋顯著減少，而β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲含量增加，這是由于蛋白質(zhì)肽鏈中引入葡萄糖，其空間位阻效應(yīng)引起無規(guī)卷曲含量增加[9]；另一方面，游離氨基參與反應(yīng)，分子間氫鍵遭到破壞，減弱了蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子充分伸展。經(jīng)不同壓力DHPM處理后BSA糖基化產(chǎn)物的α-螺旋向β-折疊和無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)變，這是因?yàn)锽SA經(jīng)高壓處理后結(jié)構(gòu)更為松散，與Zhang Min等[25]報(bào)道相同。

表1 DHPM不同壓力下BSA-葡萄糖體系的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 1 Secondary structure contents of BSA-glucose system after DHPM at various pressureess%

3 結(jié) 論

BSA-葡萄糖經(jīng)DHPM處理后糖基化產(chǎn)物的游離氨基、熱穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定變化。BSA糖基化后游離氨基明顯減少，隨著壓力的增大游離氨基含量先減少后增加；糖基化后BSA的熱穩(wěn)定性顯著提高，變性溫度由原來87.2℃升高到104.1℃，經(jīng)DHPM不同壓力處理后，其熱變性溫度隨壓力增大逐漸升高；利用紅外光譜和圓二色譜分析表明二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。這些變化說明BSA與葡萄糖發(fā)生共價(jià)交聯(lián)時(shí)改變了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致游離氨基含量明顯減少，DHPM不同壓力處理，造成BSA聚集狀態(tài)不同程度的破壞，同時(shí)使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，使得游離氨基隨著壓力增加有略微下降趨勢，以上結(jié)果說 明DHPM預(yù)處理促進(jìn)了BSA-葡萄糖體系的糖基化反應(yīng)。

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Effect of Dynamic High Pressure Microfluidization on Glycation of Bovine Serum Albumin

TU Zongcai, YU Li, HUANG Xiaoqin
(College of Life Science, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China)

The effect of dynamic high pressure microfluidization (DHPM) with different pressure (40, 80, 120, and 160 MPa) on the properties and structure of bovine serum albumin (BSA)-glucose dry glycosylation reaction products was investigated by colorimetry, differential scanning calorimetry, infrared spectroscopy, and circular dichroism spectrum. After DHPM treatment, the content of free amino group in BSA-glucose glycosylation products was significantly reduced, which first decreased and then increased with increasing pressure. Differential scanning calorimetry analysis showed that the thermal stability of glycosylation products first increased and then decreased as the pressure increased. Infrared spectroscopy and circular dichroism spectrum analysis showed changed secondary structure. These results indicate that DHPM can promote the glycosylation of BSA-glucose system.

bovine serum albumin; dynamic high pressure microflu idization; glycosylation; structure

TS201.2

1002-6630（2015）11-0017-04

10.7506/spkx1002-6630-201511004

2014-06-30

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（2007DA105064）

涂宗財(cái)（1965—），男，教授，博士，主要從事極端條件下食品蛋白質(zhì)營養(yǎng)與安全研究。E-mail：tuzc_mail@aliyun.com