夏旺旭徐 露

（1.重慶市長壽區(qū)人民醫(yī)院，重慶 400012；2.重慶醫(yī)科大學，重慶 400016）

·研究報告·

燈盞花素對腦梗死大鼠腦保護作用的影像學觀察及機制研究*

夏旺旭1徐 露2△

（1.重慶市長壽區(qū)人民醫(yī)院，重慶 400012；2.重慶醫(yī)科大學，重慶 400016）

目的采用核磁共振（MRI）技術，觀察燈盞花素對腦梗死大鼠的保護作用并探索其機制。方法120只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、尼莫地平組和燈盞花素組。除空白組外，其余各組動物腦制造腦梗死模型，尼莫地平組和燈盞花素組于梗死后每日腹腔注射尼莫地平1 mg/kg和燈盞花素4 mg/kg，模型組注射同等體積0.9%氯化鈉注射液，連續(xù)4 d。缺血后24 h、48 h和96 h，用MRI對大鼠兩側紋狀體區(qū)和頂顳葉區(qū)進行T1-SE及DW-EPI序列掃描，分析表觀彌散系數(shù)（ADC）值的變化；并用干濕重法計算腦含水量及western法檢測APQ4水平的變化。結果與模型組相比，燈盞花素組組大鼠腦缺血后24 h、48 h及96 h，左側紋狀體和頂顳葉相對ADC值著增加（P＜0.01），腦含水量及APQ4值顯著降低（P＜0.01），而尼莫地平組和燈盞花素組相當（P＞0.05）。結論燈盞花素對腦缺血再灌注損傷大鼠有一定的減輕腦水腫的作用，其機制可能與抑制APQ4的表達有關。

腦梗死 燈盞花素 ADC APQ4

燈盞花素是從菊科植物燈盞花中提取的黃酮類有效成分，主要成分是燈盞乙素，具有廣泛的藥理活性，如改善微循環(huán)、擴張血管、增加血流量、調(diào)節(jié)血脂、抗血栓、降低血黏度等。文獻研究表明燈盞花素對腦缺血再灌注損傷和心肌缺血均有保護作用。目前，利用MRI法觀測燈盞花素對急性腦梗死大鼠腦水腫和腦梗死體積的作用的研究尚未見報道。為進一步揭示燈盞花素對腦梗死的影響，本研究以大鼠腦梗死為實驗研究模型，觀察燈盞花素對腦梗死大鼠MRI、腦水腫及APQ4蛋白的影響。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物 實驗采用SPF級成年雄性SD大鼠120只，體質量（250±20）g，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 試劑與儀器 燈盞花素注射液，購至湖南恒生制藥有限公司，燈盞花素注射液1 mg溶解于0.9%氯化鈉注射液1 mL中。尼莫地平，購至通化神源藥業(yè)有限公司。APQ4抗體購至Santa Cruz。Siemens 1.5 T磁共振儀，SynGENE凝膠成像系統(tǒng)等。

1.3 分組與造模 SPF級成年雄性SD大鼠120只隨機分為4組：空白組（n=30）、模型組（n=30）、尼莫地平組（n=30）和治療組（n=30）。除空白組外，采用Longa等的線栓法制備大鼠左側大腦中動脈永久缺血腦梗死模型［2］。

1.4 給藥 參照文獻報道［1］，治療組按照4 mg/kg劑量每日腹腔注射燈盞花素，對照組注射0.9%氯化鈉注射液1 mL。尼莫地平組每日腹腔注射尼莫地平1 mg/kg。

1.5 觀察指標 1）核磁共振掃描和圖像分析：MRI檢測在重慶醫(yī)科大學生物工程中心核磁共振室完成。梯度場設為40 mT/m，軸向的轉換速率設為400 T/（m· s）。4組大鼠分別在腦梗死后24 h、48 h和96 h進行掃描。掃描使用Rat Coil，且大鼠保持在相同位置。腦梗死后24 h、48 h和96 h分別完成如下序列：T1自旋回波序列（T1SE），TR 600 ms，TE 13 ms，F(xiàn)OV read 50 mm，層厚1 mm，層數(shù)15層，Averages 4，F(xiàn)lip angle 90°，Base resolution256×256。DW-EPI序列，TR3300ms，TE99ms，層厚2 mm，層數(shù)8層，F(xiàn)OV read 67 mm，Averages 4，Base resolution 100×100。完成序列掃描的順序為：DWEPI和T1-TSE。掃描后，使用ImageJ軟件對圖像進行分析。選取同一定位層面的掃描序列圖像 （額皮質前尖部后7 mm的冠狀切面）進行分析。在此層面選取缺血側紋狀體區(qū)、頂顳葉區(qū)，對側紋狀體區(qū)和頂顳葉區(qū)4個區(qū)域。然后計算4區(qū)域在缺血后24 h、48 h和96 h的ADC值。本研究采用相對ADC值進行比較以減少動物個體差異影響。相對ADC值=患側ADC值/健側ADC值。2）腦含水量的檢測：每組于腦梗死后24 h、48 h和96 h時間點，分別處死5只大鼠，迅速取出腦組織，去除小腦、腦干和嗅球，用濾紙吸取多余水分后稱其濕重。隨后放入恒溫電熱箱中于105℃烘烤至恒重，稱其干重。按照如下公式計算腦組織含水量：腦含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。3）腦APQ4表達的測定：每組于腦梗死后24 h、48 h和96 h時間點，分別處死5只大鼠，迅速取出腦組織，提取總蛋白。Western blot法檢測APQ4蛋白的表達。Image lab軟件計算目的蛋白和β-actin條帶灰度值。APQ4值的表達量由目的蛋白和β-actin條帶灰度值的比值表示。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件。實驗數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組紋狀體區(qū)缺血后 24 h、48 h和 96 h相對ADC值比較 見表1。缺血后24 h、48 h和96 h，于紋狀體區(qū)，模型組相對ADC值均小于空白組、尼莫地平組及燈盞花素組（P＜0.01），而尼莫地平組和燈盞花素組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組紋狀體區(qū)缺血后各時點相對ADC值比較（±s）

表1 各組紋狀體區(qū)缺血后各時點相對ADC值比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.01。下同。

組別n 9 6 h 2 4 h 4 8 h空白組 5 0 . 9 9 ± 0 . 0 8*模型組 5 0 . 6 9 ± 0 . 0 3尼莫地平組 5 0 . 8 8 ± 0 . 0 8*0 . 9 9 ± 0 . 0 9*1 . 0 2 ± 0 . 0 6*0 . 6 2 ± 0 . 0 8 0 . 5 3 ± 0 . 0 4 0 . 9 0 ± 0 . 0 6*0 . 7 9 ± 0 . 0 7*燈盞花素組 5 0 . 9 0 ± 0 . 0 5*0 . 9 2 ± 0 . 0 3*0 . 8 1 ± 0 . 0 6*

2.2 各組頂顳葉區(qū)缺血后 24 h、48 h和96 h相對ADC值的變化 見表2。缺血后24 h、48 h和96 h，模型組相對ADC值均小于空白組、尼莫地平組及燈盞花素組（P＜0.01），而尼莫地平組和燈盞花素組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 各組頂顳葉區(qū)缺血后各時點相對ADC值比較（分，±s）

組別n 9 6 h 2 4 h 4 8 h空白組 5 0 . 9 9 ± 0 . 0 6*模型組 5 0 . 7 7 ± 0 . 0 4尼莫地平組 5 0 . 9 3 ± 0 . 0 5*0 . 9 8 ± 0 . 0 7*1 . 0 1 ± 0 . 0 8*0 . 7 5 ± 0 . 0 3 0 . 6 1 ± 0 . 0 2 0 . 9 8 ± 0 . 0 6*0 . 8 2 ± 0 . 0 5*燈盞花素組 5 0 . 9 5 ± 0 . 0 3*0 . 9 7 ± 0 . 0 5*0 . 8 3 ± 0 . 0 4*

2.3 各組腦含水量比較 見表3。缺血后24 h、48 h和96 h，模型組腦含水量值均高于空白組、尼莫地平組及燈盞花素組（P＜0.01），而尼莫地平組和燈盞花素組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 各組缺血后各時點腦含水量比較（±s）

表3 各組缺血后各時點腦含水量比較（±s）

組別n 9 6 h 2 4 h 4 8 h空白組 5 0 . 7 0 ± 0 . 0 3*模型組 5 0 . 8 1 ± 0 . 0 4尼莫地平組 5 0 . 7 3 ± 0 . 0 5*0 . 7 1 ± 0 . 0 4*0 . 6 9 ± 0 . 0 5*0 . 8 6 ± 0 . 0 7 0 . 8 4 ± 0 . 0 6 0 . 7 7 ± 0 . 0 5*0 . 7 4 ± 0 . 0 3*燈盞花素組 5 0 . 7 2 ± 0 . 0 4*0 . 7 5 ± 0 . 0 5*0 . 7 2 ± 0 . 0 3*

2.4 各組腦APQ4表達的測定 見表4。缺血后24 h、48 h和96 h，模型組腦APQ4蛋白的表達均高于空白組、尼莫地平組及燈盞花素組（P＜0.01），而尼莫地平組和燈盞花素組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討 論

腦梗死后腦組織缺血、缺氧會引起腦水腫。腦水腫程度與腦梗死的損傷尤其是梗死灶大小密切相關，腦損傷嚴重者相應腦水腫也會嚴重［3］。腦水腫進一步發(fā)展就會發(fā)生神經(jīng)細胞凋亡、壞死。腦水腫在腦組織損傷后立即發(fā)生，在24～72 h最為明顯，持續(xù)時間約為1周［4］。腦水腫程度可以判斷腦梗死后腦損傷的嚴重程度，在腦梗死發(fā)生初期如果能及時控制腦水腫，對疾病的轉歸和愈后具有重要的意義［5］。

表4 各組缺血后各時點腦APQ4蛋白的表達（±s）

表4 各組缺血后各時點腦APQ4蛋白的表達（±s）

組別n 24 h 48 h96 h空白組 5 0.046±0.022*0.044±0.023*0.047±0.020*模型組 5 0.133±0.056 0.130±0.0520.128±0.054尼莫地平組 5 0.064±0.033*0.060±0.036*0.055±0.032*燈盞花素組 5 0.060±0.028*0.056±0.027*0.050±0.025*

隨著MRI技術的興起與發(fā)展，腦水腫的程度和發(fā)展情況能夠被監(jiān)測。在細胞毒性水腫和神經(jīng)元細胞皺縮發(fā)生過程中，ADC值是重要的敏感參數(shù)；腦缺血急性期，由于腦細胞缺血缺氧，膜去極化，細胞外水分子轉移到細胞內(nèi)，使得ADC值發(fā)生變化［6］。在腦缺血急性期，缺血區(qū)域的ADC值明顯下降，ADC值越低表明腦損傷越嚴重。動物實驗表明，ADC下降程度與急性腦缺血后的組織損傷程度有一定相關性［7］。DWI能反映水分子擴散特性，對水分子運動擴散十分敏感。DWI的信號直接與ADC值有關，兩者信號強度相反。ADC值可通過對DWI影像物理參數(shù)的測量計算得出［8］。腦梗死大鼠紋狀體和頂顳葉區(qū)的ADC變化由表1和表2可以看出，腦梗死大鼠ADC的變化為先降低后逐漸升高，這與之前的文獻報道［7］相一致，說明此時腦梗死大鼠正從梗死急性期往亞急性期過度。比較模型組和治療組大鼠，在腦梗死后24 h、48 h及96 h時間點，燈盞花素組大鼠能顯著升高腦梗死大鼠紋狀體和頂顳葉區(qū)的ADC值，說明燈盞花素具有降低腦梗死大鼠急性期腦水腫的作用。

APQ4蛋白是分布于膠質細胞膜區(qū)和室管膜細胞的一種雙向水轉運通道，它是膠質細胞-腦脊液-血管水調(diào)節(jié)和轉運的重要物質［9］。APQ4與腦水腫關系密切，在腦梗死的發(fā)生和發(fā)展過程中其都有不同程度的表達。研究表明，APQ4基因敲除鼠在腦缺血后星型膠質細胞腫脹及腦組織含水量均顯著低于野生型小鼠，表明APQ4與腦缺血后的腦水腫關系密切［10］。本研究結果示，在腦梗死后24 h、48 h及96 h時間點，燈盞花素能顯著降低腦梗死大鼠腦含水量及APQ4蛋白的表達，說明燈盞花素可能是通過抑制APQ4的表達來減輕腦水腫。尼莫地平是公認的治療腦梗死的有效藥物，能顯著改善腦水腫情況，從各項觀測指標看來，燈盞花素組和尼莫地平組無顯著性差異，表明燈盞花素與尼莫地平作用相似。

另外，腦梗死屬中醫(yī)學“中風”范疇，其病因以內(nèi)傷積損為主，即臟腑失調(diào)，陰陽偏勝?；钛?、息風通絡是“中風”主要治法之一。燈盞花素是中藥燈盞花的主要有效成分，具有活血化瘀、通絡止痛的作用。因此，可采用燈盞花素治療“卒中”，這與本實驗結論相符。

綜上所述，通過MRI的方法，我們可以直觀地發(fā)現(xiàn)燈盞花素對大鼠永久性中動脈梗塞模型所導致的缺血性腦損傷有明顯的保護作用，其機制可能與燈盞花素抑制APQ4蛋白的表達有關。

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Imaging Observations and Mechanism Research of the Protective Effect of Breviscapine on Rats with Cerebral Infarction

XIA Wangxu，XU Lu. People's Hospital of Changshou District of Chongqing，Chongqing 400012，China

Objective：To observe the protective effects and mechanism of breviscapine on rats with cerebral infarction by the means of MRI.Methods：120 SD rats were randomly divided into the control group（n=30），model group（n=30），nimodipine group（n=30）and breviscapine group（n=30）.The rats were made into cerebral infarction model，except the control group.The breviscapine group received intraperitoneal injection of breviscapone treatment with the dose of 4 mg/kg per day for 4 days after the surgery.Nimodipine group received intraperitoneal injection of breviscapone treatment with the dose of 1 mg/kg per day.The rats in the control group received the same dose of saline injection.At 24 h，48 h and 96 h after MCAO，the striatum and parietotemporal cortex were scanned with MRI，as well as the sequence of T1-SE and DW-EPI and the changes of ADC values were analyzed. The value of brain water content and APQ4 expression were calculated.Results：Compared with model group，the relative ADC value of the striatum and parietotemporal cortex in breviscapone group significantly increased（P＜0.01），and brain water content and APQ4 decreased，at 24 h，48h and 96h after MCAO（P＜0.01），and there was no difference between nimodipine group and breviscapine group（P＞0.05）.Conclusion：Breviscapone can reduce the cerebral edema after cerebral ischemia and mitigate further damage of brain.

Breviscapine；Cerebral infarction，ADC，APQ4

R285.5

A

1004-745X（2015）06-0950-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.06.005

2015-01-16）

重慶市第六屆“步長杯”腦血管病科學研究基金面上項目（BCB2012010）

△通信作者（電子郵箱：30067011@qq.com）