蘇 芳 易翠平

（長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，長沙 410114）

稻米中鎘快速檢測金標(biāo)試紙條的研制

蘇 芳 易翠平

（長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，長沙 410114）

制備一種用于快速檢測稻米中重金屬鎘的金標(biāo)試紙條。將完全抗原Cd-iEDTA-BSA作為T線，羊抗鼠二抗作為C線，包被于硝酸纖維素膜上，納米金顆粒標(biāo)記的7E8G9單克隆抗體包被于金標(biāo)墊上，組裝成金標(biāo)試紙條。試紙條的靈敏度為0.2μg／mL、重復(fù)性良好、與Hg2+有較強(qiáng)交叉，最高共存濃度不得高于1.0μg／mL；與 Zn2+有一定交叉，最高共存濃度不得高于 10μg／mL；與 Cu2+、Fe2+、Ca2+、Mg2+、Al3+、Pb2+幾乎無交叉；貯存期約為1年。試紙條檢測稻米中鎘與GFAAS結(jié)果一致。成功制備了金標(biāo)試紙條，并應(yīng)用于快速檢測稻米中重金屬鎘。

稻米 鎘 納米金 試紙條

鎘作為一種蓄積性毒物、易導(dǎo)致人體骨折、高血壓、癌癥和腎功能紊亂等疾病［1-2］，因此在食品中應(yīng)及時(shí)檢出。水稻是對(duì)鎘吸收最強(qiáng)的谷類作物，其超標(biāo)率達(dá)10.3%［3］，而我國一半以上人口以稻米為主食，因此快速檢測其是否超標(biāo)具有極其重要的意義。常用于稻米中鎘的檢測方法有原子吸收法、電化學(xué)分析法、溶出伏安法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法以及各種方法的聯(lián)用，但這些設(shè)備昂貴、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、需要專門的技術(shù)人員，難以進(jìn)行現(xiàn)場和大規(guī)模的檢測［4］。為此迫切需要找到一種現(xiàn)場、快速、高效的檢測技術(shù)。研究報(bào)道，膠體金免疫層析技術(shù)在黃曲霉毒素［5］、鹽酸克倫特羅［6］、三聚氰胺［7］、重金屬鉻［8］的檢測上具有攜帶方便、操作簡單、成本低廉、快速檢測、結(jié)果肉眼可見等優(yōu)點(diǎn)，適于對(duì)大批量樣品進(jìn)行現(xiàn)場初篩。劉斌等［9］建立了快速檢測環(huán)境水樣中重金屬鎘殘留的膠體金免疫層析法，但目前此類產(chǎn)品在稻米上的應(yīng)用鮮見報(bào)道。

本研究擬在前期研究已制備重金屬鎘完全抗原Cd-iEDTA-BSA和高親和力的單克隆抗體［10］的基礎(chǔ)上，結(jié)合膠體金免疫層析技術(shù)，開發(fā)一種檢測限為0.2 mg／kg［11］定性檢測金標(biāo)試紙條，用于現(xiàn)場、快速檢測稻米中重金屬鎘含量是否超標(biāo)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

JY-EQ07膠體金噴墨劃線機(jī)、JY-EQ01斬切式切膜機(jī)：上海杰一生物技術(shù)有限公司；DZ400真空包裝機(jī)：溫州市永豐包裝機(jī)械廠；硝酸纖維素膜（NC膜）、金標(biāo)墊、樣品墊、吸水紙、支持板、鋁箔袋、干燥劑、塑料卡盒：Millipore公司；AA6800石墨爐原子吸收分光光度計(jì)：島津公司；Multiskan MK3酶標(biāo)儀：Thermo公司；96孔酶標(biāo)板：Corning／Costar公司。

1.1.2 原料和試劑

氯金酸 HAuCl4：Aladdin公司；羊抗鼠 IgG：Sigama；iEDTA：日本同仁化學(xué)研究所；牛血清白蛋白（BSA）：瑞士 Roche公司；鎘含量為0.106 3、0.210 2、0.428 3 mg／kg的稻米：長沙市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局提供；完全抗原 Cd-iEDTA-BSA：前期研究制備［10］；7E8G9單克隆抗體（以下簡稱單抗，效價(jià)1∶256 000，親和常數(shù) Ka為 2.20×108L／mol）：前期研究制備［10］。

1.2 方法

1.2.1 納米金溶液的制備

儀器清洗、滅菌及硅烷化處理后，在 Frens［12］的方法上改進(jìn)：取100 mL 0.01%氯金酸沸騰2 min后加入3.5 mL 1%檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱10 min，至溶液變?yōu)榫萍t色，沸騰8 min，至溶液顏色不再變化時(shí)，停止加熱，冷卻，并用蒸餾水將體積補(bǔ)充至100 mL，4℃棕色瓶避光保存，紫外分光光度計(jì)（UV）［13］和透射電子顯微鏡（TEM）［14］進(jìn)行鑒定。

1.2.2 金標(biāo)抗體的制備

1.2.2.1 最佳單抗用量的的確定

采用Mey氏穩(wěn)定試驗(yàn)［15］：取 5支 1.5 mL的離心管，編號(hào)；分別加入1mL pH 8.2［16］的納米金溶液；分別加入100μL 30、40、50、60、70μg／mL的單抗；各加入100μL 10%NaCl溶液；觀察膠體金顏色變化情況，確定顏色未發(fā)生變化的最少抗體用量。實(shí)際使用時(shí)適當(dāng)增加抗體用量10%～30%，本試驗(yàn)選擇增加20%。

1.2.2.2 金標(biāo)抗體的制備

取1 mL膠體金溶液，用0.1 mol／L K2CO3調(diào)節(jié)至最佳pH 8.2；邊攪拌邊逐漸加入最適量的單抗，大約5 min內(nèi)加完，再繼續(xù)攪拌30 min；再逐滴加入10%BSA，使其終濃度為1%，繼續(xù)攪拌20 min；低速離心：將標(biāo)記好的膠體金溶液在4℃，2 000 r／min條件下離心15 min，小心吸出上清，棄沉淀；高速離心：將上清于4℃，11 000 r／min條件下離心12 min，棄上清；加500μL PBS（含4%PEG-20 000）復(fù)溶，再在相同條件下離心洗滌2～3遍；重懸于10倍濃縮PBS（含1.5%BSA和5%蔗糖）中，4℃冰箱過夜。

1.2.3 免疫層析條件的優(yōu)化

1.2.3.1 T線濃度的確定

選定C線濃度為1.5 mg／mL，分別將Cd-iEDTA-BSA稀釋為0.8、1.0、1.2 mg／mL，在 NC膜上劃線，與同濃度金標(biāo)抗體組裝成試紙條，添加100μL 0.01 mol／L pH 7.4 PBS進(jìn)行檢測，比較T線隨濃度變化試紙條的顯色情況和穩(wěn)定性。

1.2.3.2 C線濃度的確定

選定T線濃度為1.0 mg／mL，分別將羊抗鼠IgG稀釋為1.0、1.5、2.0 mg／mL，在 NC膜上劃線，與同濃度金標(biāo)抗體組裝成試紙條，添加100μL 0.01 mol／L pH 7.4PBS進(jìn)行檢測，比較C線隨濃度變化試紙條的顯色情況和穩(wěn)定性。

1.2.3.3 金標(biāo)抗體最佳工作濃度的確定

用0.01mol／L pH 7.4 PBS將金標(biāo)抗體分別進(jìn)行0.6倍、0.7倍、0.75倍稀釋及不稀釋；噴于金標(biāo)墊上，干燥后與 1.0 mg／mL的抗原，1.5 mg／mL的羊抗鼠二抗包被在NC膜上制備試紙條，進(jìn)行檢測，選擇顯色清晰的最低濃度金標(biāo)抗體作為以最適金標(biāo)抗體工作濃度。

1.2.3.4 離子強(qiáng)度對(duì)試紙條實(shí)際檢測的影響

分別用 H2O、0.01 mol／L pH 7.4 PBS、0.02 mol／L pH 7.4PBS（PBS）、0.1 mol／L pH 7.4 PBS（2倍 PBS）作空載和稀釋劑進(jìn)行測定，觀察并記錄T／C線顯色情況，看是否出現(xiàn)擴(kuò)展和褪色現(xiàn)象。

1.2.4 金標(biāo)試紙條的組裝

將Cd-iEDTA-BSA和羊抗鼠IgG用pH 7.4 PBS分別稀釋至最佳工作濃度，以0.8μL／cm的噴量依次間隔5 mm劃線至NC膜上，分別作為檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線），干燥備用；將金標(biāo)抗體均勻地點(diǎn)噴在金標(biāo)墊上，點(diǎn)量為12μL／cm，干燥備用；將樣品墊、金標(biāo)墊、NC膜、吸水墊依次粘在PVC支撐板上（如圖1）；將粘好的支持板材料切成60 mm長、2.84 mm寬的試紙條，并卡在試紙卡中，放入裝有干燥劑的鋁箔袋中，真空包裝好后4℃保存。

圖1 金標(biāo)試紙條的組裝示意圖

1.2.5 金標(biāo)試紙條的使用及結(jié)果判定

1.2.5.1 金標(biāo)試紙條的使用

標(biāo)準(zhǔn)檢測物的制備：將已知濃度的Cd2+溶液與0.1 mol／L EDTA按體積比9∶1混合，得到螯合物Cd-EDTA；將冷藏的試紙條恢復(fù)至室溫；加入100 μL待測樣本，在室溫下靜置5 min判定結(jié)果。

1.2.5.2 金標(biāo)試紙條的結(jié)果判定

當(dāng)T／C線顏色深淺相同或T線顏色比C線深時(shí)，判定為陰性；當(dāng)C線顏色明顯深于T線時(shí)，判定為陽性，且C線顏色越深、T線顏色越淺說明超標(biāo)越嚴(yán)重；當(dāng)只有T線顯色，C線不顯色或T／C均不顯色時(shí)，判定為無效。

圖2 金標(biāo)試紙條結(jié)果判定示意圖

1.2.6 金標(biāo)試紙條的質(zhì)量評(píng)估

1.2.6.1 試紙條的靈敏度

將不同濃度Cd-EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液滴加到進(jìn)樣口，靜置5 min，觀察T／C線顯色情況。

1.2.6.2 試紙條的重復(fù)性

將同一濃度Cd-EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液滴加到進(jìn)樣口，靜置 5 min，觀察 T／C線顯色情況，重復(fù)6次。

1.2.6.3 試紙條的特異性

將 Hg2+、Zn2+、Cu2+、Ca2+、Fe2+、Mg2+、Al3+和Pb2+溶液與0.1 mol／L EDTA按體積比9∶1螯合后，進(jìn)行濃度梯度稀釋，滴加到進(jìn)樣口，靜置5 min，觀察T／C線顯色情況。

1.2.6.4 試紙條的穩(wěn)定性

將試紙條密封分別保存于37℃和4℃條件下，觀察不同溫度對(duì)試紙條的影響。保存于37℃的試紙條每4 d取出1條分別測定質(zhì)量濃度為0.2μg／mL Cd-EDTA標(biāo)準(zhǔn)品，保存于4℃的試紙條每周取出1條分別測定質(zhì)量濃度為0.2μg／mL Cd-EDTA標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.7 試紙條在檢測稻米中鎘的實(shí)際應(yīng)用

采用鎘含量為0.430 0 mg／kg（已用 GFAAS測定）的大米樣品進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證試驗(yàn)，具體操作步驟：稱取0.3～0.4 g稻米粉碎樣品（過60目篩），做10個(gè)平行，加一定體積硝酸，微波消解，趕酸至液體剩余體積約50μL；超純水重復(fù)趕酸3～4次；定容至3個(gè)不同體積：1）定容至 1 g大米樣品／4 mL，經(jīng)GFAAS測得鎘質(zhì)量濃度為 0.106 3μg／mL；2）定容至1 g大米樣品／2 mL，經(jīng)GFAAS測得鎘質(zhì)量濃度為0.210 2μg／mL；3）定容至 1 g大米樣品／mL，經(jīng)GFAAS測得鎘質(zhì)量濃度為0.428 3μg／mL。NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，其他同1.2.5.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米金的制備

目測納米金溶液呈酒紅色，且無漂浮，無沉淀，不渾濁，在日光燈下觀察膠體金溶液中無微小顆粒。取一定體積金溶液在200～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外-可見光掃描。由圖3可知，最大吸收峰出現(xiàn)在520.5 nm處，且波峰尖，峰寬窄，說明顆粒均一、分散性好。由透射電鏡掃描圖可知，金顆粒呈球形、大小均一、分散性良好、無凝聚現(xiàn)象、顆粒平均直徑大小為13 nm。

圖3 紫外-可見分光光度掃描圖

2.2 金標(biāo)抗體的制備

由于膠體金顆粒表面帶有負(fù)電荷，當(dāng)加入的單抗量不足時(shí)，膠體金反應(yīng)不完全，此時(shí)再加入一定濃度的NaCl溶液，則會(huì)產(chǎn)生鹽離子效應(yīng)，從而改變膠體的性質(zhì)，最終使金溶液出現(xiàn)由紅變藍(lán)的沉聚現(xiàn)象［17］，見表 1。

表1 最佳單抗添加量的確定

因此，當(dāng)單抗添加量為3.0μg時(shí)，由紅色變?yōu)樗{(lán)色，4.0μg時(shí)處于紅色和藍(lán)色變化中間，5.0、6.0、7.0μg時(shí)保持酒紅色不變，所以5.0μg為最小穩(wěn)定量（表1）。本試驗(yàn)合成金標(biāo)抗體時(shí)，在此基礎(chǔ)上增加20%的量，即最佳抗體用量為6.0μg單抗／1 mL膠體金溶液。

2.3 免疫層析條件的優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 T線濃度的確定

由表2可知，當(dāng)T線質(zhì)量濃度為0.6 mg／mL時(shí)，顯色太弱；當(dāng)T線濃度為0.8 mg／mL時(shí)，顯色較弱；當(dāng)T線質(zhì)量濃度為1.0 mg／mL時(shí)，T／C線顯色清晰，顏色相當(dāng)，容易辨別。故選擇T線包被質(zhì)量濃度為1.0 mg／mL。

表2 T線濃度的確定

2.3.2 C線濃度的確定

由表3可知，當(dāng)IgG質(zhì)量濃度為1.0 mg／mL時(shí)，T線顯色太弱；當(dāng)IgG質(zhì)量濃度為1.5 mg／mL時(shí)，T／C顯色較深，且顏色相當(dāng)；當(dāng)IgG質(zhì)量濃度為2.0mg／mL時(shí)，C線顯色過深，T線過淺。故選擇C線包被質(zhì)量濃度為1.5mg／mL。

表3 C線濃度的確定

2.3.3 金標(biāo)抗體最佳工作濃度的確定

金標(biāo)抗體的稀釋程度越高，說明試紙條的靈敏度就越高，但同時(shí)顯示紅色條帶越不明顯［18］。表4的結(jié)果表明，用H2O進(jìn)行測試時(shí)，0.6倍稀釋的T線較弱，且有一定擴(kuò)展；0.7倍稀釋的C線成形不夠規(guī)則；0.75倍稀釋度的T／C線顯色清晰，線形集中且規(guī)則；未做稀釋的T／C線顯色與0.75倍的差別不大，但是從節(jié)約原材料出發(fā)，0.75倍稀釋的更節(jié)約成本，故選擇0.75倍稀釋度的金標(biāo)抗體做試紙條。

表4 金標(biāo)抗體稀釋度的確定

2.3.4 離子強(qiáng)度對(duì)試紙條實(shí)際檢測的影響

表5是用H2O、PBS、2倍PBS作空載和稀釋劑時(shí)金標(biāo)試紙條的顯色情況。結(jié)果表明，當(dāng)離子強(qiáng)度分別為0、0.01、0.02 mol／L時(shí)，對(duì)空載影響不大，T／C線顯色幾乎沒有差別；但是當(dāng)用H2O、PBS、2倍PBS分別作稀釋劑來稀釋Cd-EDTA至目標(biāo)檢測線0.2 μg／mL，可明顯看到PBS做稀釋劑時(shí)，T線幾乎消線完全；而H2O做稀釋劑和空載時(shí)，T線出現(xiàn)擴(kuò)展和褪色現(xiàn)象，用2倍PBS做稀釋劑時(shí)，由于離子強(qiáng)度過大，會(huì)導(dǎo)致抑制顯色。故選擇 PBS（0.01 mol／L pH 7.4）做稀釋劑，此時(shí)離子物質(zhì)的量濃度為0.01 mol／L（以 Na+計(jì)）。

表5 稀釋劑離子強(qiáng)度的確定

2.4 金標(biāo)試紙條的質(zhì)量評(píng)估

2.4.1 試紙條靈敏度

表6的結(jié)果表明，0.1μg／mL Cd-EDTA上樣時(shí)，T／C線顯色情況和PBS空載一樣；0.2μg／mL Cd-EDTA上樣時(shí)，T線明顯減弱，故靈敏度為0.2μg／mL。

表6 不同濃度Cd-EDTA下試紙條的顯色情況

2.4.2 試紙條重復(fù)性

滴加0.2μg／mL Cd-EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液至6個(gè)試紙條加樣孔中，5 min后檢測結(jié)果。6次重復(fù)用0.2 μg／mL Cd-EDTA上樣時(shí)，T／C線均顯色，且顏色深淺一致，說明重復(fù)性良好。

2.4.3 試紙條的特異性

通過測定不同濃度梯度的Hg2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、Ca2+、Al3+、Mg2+和Pb2+與EDTA的螯合物，觀察試驗(yàn)結(jié)果，得到各種金屬離子螯合物的與膠體金試紙條的交叉試驗(yàn)結(jié)果，見表7。交叉反應(yīng)率公式：交叉反應(yīng)率

表7 各種金屬離子螯合物的交叉濃度

由表7可知，當(dāng)用金標(biāo)試紙條檢測Cd2+時(shí)，與Hg2+有較強(qiáng)交叉［19］，最高共存質(zhì)量濃度不得高于1.0μg／mL；與Zn2+有一定交叉，最高共存濃度不得高于 10μg／mL；與 Cu2+、Fe2+、Ca2+、Mg2+、Al3+、Pb2+幾乎無交叉。這說明試紙條測定Cd2+時(shí)，最大的干擾離子是 Hg2+，與 Bleke等［19］、張海棠等［20］、唐勇等［21］的研究結(jié)果相近。這可能是由于不同金屬-螯合劑復(fù)合物之間的結(jié)構(gòu)差異很小，容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)。

2.4.4 試紙條的穩(wěn)定性

將試紙條密封分別保存于37℃和4℃條件下，每到規(guī)定時(shí)間取出1條測定質(zhì)量濃度為0.2 μg／mLCd-EDTA標(biāo)準(zhǔn)品。結(jié)果表明，4℃條件下貯存4周，試紙條的顯色均為陽性，表明穩(wěn)定性良好；37℃條件下貯存12 d，C線略有褪色跡象，穩(wěn)定性依然較好。根據(jù)試紙條行業(yè)的經(jīng)驗(yàn)，37℃貯存1 d相當(dāng)于4℃貯存1個(gè)月［22］，故判定本試紙條貯存期約為1年。

2.5 試紙條在檢測稻米中鎘的實(shí)際應(yīng)用

樣品液中Cd2+濃度經(jīng)GFAAS測定后，再用金標(biāo)試紙條測定結(jié)果如表8。

表8 不同濃度大米樣液的試紙條測定結(jié)果

結(jié)果表明，當(dāng) Cd2+質(zhì)量濃度為0.106 3μg／mL時(shí)，試紙條T／C線顏色深淺接近，表現(xiàn)為陰性；質(zhì)量濃度為0.210 2μg／mL時(shí)，試紙條T線顏色較深，C線顏色較淺，且?guī)缀跸€，表現(xiàn)為陽性；當(dāng)質(zhì)量濃度為0.428 3μg／mL時(shí)，試紙條T線顏色深，C線完全消線，表現(xiàn)為強(qiáng)陽性。說明試紙條檢測稻米中鎘與GFAAS結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，以13 nm的膠體金顆粒標(biāo)記單抗、國家標(biāo)準(zhǔn)中稻米鎘的安全警戒線0.2 mg／mL為檢測限，制備了一種用于稻米中鎘快速檢測的定性金標(biāo)試紙條。該試紙條重復(fù)性良好，僅與Hg2+、Zn2+等離子有交叉反應(yīng)。

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Development of Colloidal Gold-Based Test Strip for the Rapid Detection of Cadmium in Rice

Su Fang Yi Cuiping

（School of Chemical and Biomedical Engineering，Changsha University of Science and Technology，Changsha 410114）

To prepare a colloidal gold-based test strip for the rapid detection cadmium in rice，synthetic antigen Cd-iEDTA-BSA and goat anti-mouse immunoglobulins were utilized in the test（T）line and control（C）line respectively.They were coated on the nitrocellulose membrane（NC）.Meanwhile，the gold nanoparticles labeled monoclonal antibody 7E8G9 was coated on colloidal gold binding cushion.The results showed that the strip had a high sensitivity of0.2μg／mL，with good repeatability and strong cross reactivity with Hg2+，whose highest concentration of coexistence was not higher than 1.0μg／mL；weak cross reactivity with Zn2+，whose highest concentration of coexistence was not higher than 10.0μg／mL；and almost no cross reactivity with Cu2+，F(xiàn)e2+，Ca2+，Mg2+，Al3+and Pb2+.The storage period was about1 year，and the detection results of the cadmium in rice by strip was consistentwith GFAAS.The colloidal gold-based test strip for the rapid detection of cadmium in ricewas proved to be prepared successfully.

rice，cadmium，gold nanoparticles，colloidal gold-based test strip

R155.5

A

1003-0174（2015）07-0111-06

國家自然科學(xué)青年基金（31301404），湖南省重大專項(xiàng)（2011FJ1002-4）

2014-01-02

蘇芳，女，1988年出生，碩士，食品質(zhì)量與安全

易翠平，女，1973年出生，教授，糧食、油脂與植物蛋白、食品安全與營養(yǎng)