羅 敏 馬海樂(lè)，2 何榮海 程 宇 周存山金 建 郭晶晶 郝俊杰

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院1，鎮(zhèn)江 212013）

（江蘇省農(nóng)產(chǎn)品物理加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，鎮(zhèn)江 212013）

水解反應(yīng)對(duì)菜籽蛋白生物利用度的影響研究

羅 敏1馬海樂(lè)1，2何榮海1程 宇1周存山1金 建1郭晶晶1郝俊杰1

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院1，鎮(zhèn)江 212013）

（江蘇省農(nóng)產(chǎn)品物理加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，鎮(zhèn)江 212013）

研究了菜籽蛋白經(jīng)酶解后在生物體內(nèi)的生物利用，考察了水解度對(duì)菜籽蛋白生物利用度的影響。將雄性SD大鼠64只，隨機(jī)分成8組，即無(wú)氮組、酪蛋白組、菜籽蛋白組、水解度（DH）為4%、8%、12%、16%、20%的水解組，每組8只。大鼠在膳食平衡3 d之后，開(kāi)始進(jìn)行代謝試驗(yàn)，測(cè)其真消化率、表觀(guān)消化率、凈蛋白利用率、生物價(jià)指標(biāo)。連續(xù)飼喂21 d之后，記錄SD大鼠的體重變化和日糧消耗量，計(jì)算蛋白功效比值和凈蛋白比。結(jié)果表明，真消化率、表觀(guān)消化率、蛋白功效比值、凈蛋白比和SD大鼠體重隨水解度的增大有降低的趨勢(shì)，DH 4%組與菜籽蛋白組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。菜籽蛋白水解之后的凈利用率要高于未水解的蛋白，但差異不顯著（P＞0.05）。與菜籽蛋白組相比，DH 4%組的生物價(jià)就已經(jīng)有了顯著的提高（P＜0.05）；而與水解度更高的組相比，DH 4%組生物價(jià)無(wú)顯著變化（P＞0.05）。綜合考慮，說(shuō)明DH 4%組具有較高的生物利用度，是適合人類(lèi)食用的優(yōu)質(zhì)蛋白。

菜籽蛋白 水解反應(yīng) 水解度 生物利用度

我國(guó)油菜籽種植面積和產(chǎn)量均居世界第一，菜籽粕作為菜籽油加工的副產(chǎn)品，所含菜籽蛋白較高，為35%～42%。菜籽蛋白氨基酸組成合理，富含賴(lài)氨酸，幾乎不存在限制性氨基酸，是重要的蛋白質(zhì)資源［1-3］。但是目前較為常用的壓軋制油工藝導(dǎo)致蛋白變性嚴(yán)重，影響著餅粕蛋白的消化利用效率。對(duì)于我國(guó)這一蛋白質(zhì)非常匱乏的國(guó)家來(lái)說(shuō)，有必要通過(guò)適度酶解的方法提高其生物利用度，提升其開(kāi)發(fā)利用的價(jià)值。同時(shí)，酶解過(guò)程產(chǎn)生的一些肽類(lèi)小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在人體中也會(huì)發(fā)揮重要的生理活性功能［4-5］。

“生物利用度”這一概念在醫(yī)藥行業(yè)中廣泛使用，它能夠反映所給藥物進(jìn)入人體循環(huán)的藥量比例，描述口服藥物由胃腸道吸收之后，經(jīng)過(guò)肝臟后而到達(dá)體循環(huán)血液中的藥量占口服劑量的百分比［6］。相對(duì)應(yīng)的，作為蛋白質(zhì)產(chǎn)品品質(zhì)的重要衡量指標(biāo)，蛋白的生物利用度可以用表觀(guān)消化率、真消化率、凈蛋白利用率、生物價(jià)等指標(biāo)來(lái)衡量。目前，對(duì)蛋白的消化率的測(cè)定主要有2種方法：體外法和體內(nèi)法。體外消化法是利用消化酶在試管內(nèi)進(jìn)行消化試驗(yàn)，從而快速測(cè)定原料的相對(duì)利用率，其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、快捷。但是，蛋白在體內(nèi)的消化、吸收、利用是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，體外消化法無(wú)法反應(yīng)體內(nèi)消化的真實(shí)情況。本研究采用國(guó)際上通用的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)方法（AOAC），對(duì)生長(zhǎng)期SD大鼠進(jìn)行了氮代謝的試驗(yàn)研究，能夠準(zhǔn)確評(píng)價(jià)蛋白的生物利用度。

本試驗(yàn)以菜籽蛋白為原料，為闡明不同水解度蛋白吸收、轉(zhuǎn)化及利用機(jī)制，針對(duì)不同水解度的菜籽蛋白質(zhì)，從動(dòng)物水平研究確定不同水解度菜籽蛋白的吸收、轉(zhuǎn)化和利用的代謝規(guī)律，探明蛋白質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程及與水解度的關(guān)系，為提高蛋白的生物利用，特別是為消化代謝能力較差的患者提供易吸收、生物利用度高的特殊膳食食品的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 原料

菜籽蛋白（含水率9.9%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)53%）：湖北維普生物科技有限公司；堿性蛋白酶Alcalase 2.4L FG（2.4 AU）：諾維信生物技術(shù)有限公司；酪蛋白粉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

PHS-2C型數(shù)顯pH計(jì)：上海理達(dá)儀器有限公司；HH-S型數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠(chǎng)；LD5-2A型離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠(chǎng)；UDK 149型凱氏定氮儀：意大利VELP儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

初斷乳的SD雄性大鼠64只，體重44 g左右，江蘇大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心提供。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 不同水解度菜籽蛋白的制備

稱(chēng)取菜籽蛋白原料，配成的蛋白水溶液21.2 g／L，置于水浴鍋中，待其溫度達(dá)到50℃，調(diào)節(jié)溶液pH值為9.0后迅速加入1.17 g／L Alcalase2.4L FG，進(jìn)行水解，反應(yīng)中滴加5 mol／L NaOH，采用pH-stat法維持在所需要的pH值，并測(cè)定DH值。水解完之后，100℃水浴下滅酶處理10 min。分別制備DH為4%、8%、12%、16%和20%的菜籽蛋白水解液，為后續(xù)SD大鼠飼料的制備做準(zhǔn)備。

水解度按照pH-stat法［7］進(jìn)行測(cè)定，蛋白含量按照微量凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定，以下相同。

1.4.2 不同水解度菜籽蛋白的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率

蛋白經(jīng)水解之后，上清液中的含氮量占底物蛋白含氮量的百分比被定義為產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率，即

產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率＝（上清液中的含氮量／底物蛋白含氮量）×100%

菜籽蛋白經(jīng)水解、滅酶后，冷卻至室溫，在3 500 r／min下離心10 min，收集上清液，用凱氏定氮法測(cè)定上清液的含氮量。測(cè)定不同水解度下產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率。

1.4.3 動(dòng)物分組與飼養(yǎng)

SD大鼠按體重順序，隨機(jī)分為8組，每組各8只，各組動(dòng)物平均體重組間差不大于5 g，組內(nèi)體重差不大于10 g。SD大鼠在江蘇大學(xué)動(dòng)物房?jī)?nèi)分籠飼養(yǎng)，室溫控制為（24±1）℃，室內(nèi)相對(duì)濕度（RH）＝（60±5）%，自由進(jìn)食飲水。參照AOAC991.29中蛋白質(zhì)的表觀(guān)消化率測(cè)定方法中飼料要求配制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料，具體配方：蛋白10%、維生素1%、礦物質(zhì)3.5%、膳食纖維5%、玉米油10%、其他由玉米淀粉補(bǔ)充到100%。

動(dòng)物飼養(yǎng)稱(chēng)重試驗(yàn)分為水解度為4%、8%、12%、16%和20%5個(gè)試驗(yàn)組和酪蛋白組、菜籽蛋白未水解組與無(wú)氮組3個(gè)對(duì)照組。5個(gè)不同水解度組蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為：10.69%、9.98%、10.33%、11.02%、10.96%；酪蛋白組和菜籽蛋白未水解組蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為：9.81%和10.4%；無(wú)氮組大鼠飼以無(wú)氮飼料。

1.4.4 氮代謝試驗(yàn)

蛋白質(zhì)的真消化率、表觀(guān)消化率、凈蛋白利用率和生物價(jià)指標(biāo)是氮代謝研究的主要指標(biāo)，科學(xué)研究中習(xí)慣上用氮的代謝來(lái)表示蛋白質(zhì)的代謝。蛋白質(zhì)的真消化率（True digestibility，TD）是指食物蛋白質(zhì)中被消化吸收的氮量占該蛋白質(zhì)總氮量的百分比；糞代謝量較低，如略去不記的話(huà)，則測(cè)得的結(jié)果稱(chēng)為表觀(guān)消化率（Apparent digestibility，AD）［8］；凈蛋白質(zhì)利用率（Net protein utilization rate，NPUR）是指在一定的條件下，體內(nèi)儲(chǔ)留的蛋白質(zhì)量占攝入蛋白質(zhì)量的百分比，是生物學(xué)方法評(píng)價(jià)食物中蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量的常用指標(biāo)之一，用來(lái)表示攝入的蛋白質(zhì)在體內(nèi)實(shí)際被利用的程度［8］；蛋白質(zhì)的生物學(xué)價(jià)值簡(jiǎn)稱(chēng)“生物價(jià)”或“生物效價(jià)”（Biological value，BV），指食物中蛋白質(zhì)經(jīng)消化吸收后在體內(nèi)被利用的氮量（貯留氮量）占被吸收氮量的百分比［8］。

氮代謝試驗(yàn)包括3 d的適應(yīng)期和5 d的平衡期。在平衡期內(nèi)，記錄每天大鼠所消耗的飼料，并收集大鼠的糞便和尿液，置于-20℃的冰箱保存，用于對(duì)飼料真消化率、表觀(guān)消化率、凈蛋白利用率、生物價(jià)指標(biāo)的測(cè)定［8］。上述4項(xiàng)指標(biāo)計(jì)算公式為：

TD＝［食物總氮量-（糞氮量-糞代謝氮）／食物總氮量］×100%

AD＝（食物總氮量-糞氮量／食物總氮量）×100%

NPUR＝［食物總氮量-（糞氮-代謝氮）-（尿氮-內(nèi)生氮）／食物總氮量］×100%

BV＝［食物總氮量-（糞氮-代謝氮）-（尿氮-內(nèi)生氮）］／［食物總氮量-（糞氮-代謝氮）］×100%

1.4.5 大鼠生長(zhǎng)試驗(yàn)

蛋白質(zhì)功效比（Protein efficiency ratio，PER）又稱(chēng)“蛋白質(zhì)效價(jià)”，為測(cè)定攝入單位質(zhì)量蛋白質(zhì)的體重增加值，一般指按規(guī)定的方法（AOAC法），在規(guī)定的喂養(yǎng)時(shí)間內(nèi)（通常為14～28 d），測(cè)量動(dòng)物體重增加量與蛋白質(zhì)攝入量，進(jìn)行計(jì)算。凈蛋白比（Net protein ratio，NPR）是在蛋白質(zhì)功效比的基礎(chǔ)上改進(jìn)而來(lái)，即考慮到無(wú)氮組動(dòng)物體重的減輕。

以無(wú)氮組、酪蛋白組、菜籽蛋白未水解組為對(duì)照組，用不同水解度菜籽蛋白飼養(yǎng)SD大鼠，測(cè)定大鼠體重的變化，觀(guān)察大鼠的生長(zhǎng)性能。每3 d和周末測(cè)量1次大鼠的體重及所消耗的飼料，試驗(yàn)期為21d，并計(jì)算蛋白功效比值和凈蛋白比［8］。計(jì)算公式為：

PER＝體重增加值（g）／蛋白質(zhì)攝入量（g）

NPR＝（試驗(yàn)動(dòng)物體重的增加值（g）+無(wú)氮組動(dòng)物體重減輕值（g））／蛋白質(zhì)攝入量（g）

1.4.6 統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 菜籽蛋白水解度對(duì)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的影響

菜籽蛋白酶解之后，不同水解度對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率如圖1所示。從圖1可以看出，隨著水解度的增大，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率也增大。在較低水解度時(shí)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率與水解度基本上呈線(xiàn)性正相關(guān)，在較高水解度時(shí)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率增長(zhǎng)較緩慢。原因可能是初步水解時(shí)，主要是菜籽蛋白大分子的斷裂；當(dāng)水解度較大時(shí)，越來(lái)越多的可溶性多肽參與到酶解過(guò)程中來(lái)，因此，轉(zhuǎn)化率與初始水解時(shí)相比，增長(zhǎng)得較緩慢。

圖1 不同水解度菜籽蛋白對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率

2.2 水解度對(duì)菜籽蛋白真消化率和表觀(guān)消化率的影響

消化率能反映食物蛋白質(zhì)在消化道內(nèi)被分解和吸收的程度。不同水解度對(duì)菜籽蛋白真消化率和表觀(guān)消化率的影響結(jié)果如表1。數(shù)據(jù)顯示，其他各組與酪蛋白組相比，蛋白的真消化率和表觀(guān)消化率要明顯的低（P＜0.01）。菜籽蛋白組與DH 4%組相比，真消化率和表觀(guān)消化率無(wú)顯著差異（P＞0.05），但是與其他各菜籽蛋白水解組相比，真消化率和表觀(guān)消化率要高，有顯著差異（P＜0.05）；各水解組之間均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。從整體看，菜籽蛋白經(jīng)水解之后，其平均真消化率和表觀(guān)消化率反而有所降低。

表1 不同水解度對(duì)菜籽蛋白真消化率和表觀(guān)消化率的影響／%

2.3 水解度對(duì)菜籽蛋白凈利用率的影響

蛋白凈利用率越高，說(shuō)明機(jī)體對(duì)蛋白的利用更加完全徹底。水解度對(duì)菜籽蛋白凈利用率的影響結(jié)果如表2所示。與其他組相比，酪蛋白組蛋白的凈利用率最高，差異極顯著（P＜0.01）。不同菜籽蛋白水解組的平均凈利用率值均要高于菜籽蛋白未水解組，但沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。說(shuō)明，菜籽蛋白水解在一定程度上有助于SD大鼠對(duì)菜籽蛋白的利用。

2.4 水解度對(duì)菜籽蛋白生物價(jià)的影響

蛋白質(zhì)的生物學(xué)價(jià)值可表示其消化吸收后的利用程度，也是衡量體內(nèi)代謝的常用指標(biāo)之一。水解度對(duì)菜籽蛋白生物價(jià)的影響結(jié)果見(jiàn)表3，從表3可以看出，菜籽蛋白的生物價(jià)要明顯低于酪蛋白的生物價(jià)（P＜0.01）；各水解組與酪蛋白組相比，無(wú)顯著差異（P＞0.05）。與菜籽蛋白未水解組相比，各水解組的生物價(jià)都要高（P＜0.05）；各水解組之間生物價(jià)無(wú)顯著變化（P＞0.05）。結(jié)果說(shuō)明，菜籽蛋白經(jīng)低程度水解之后，生物價(jià)得到顯著提高，當(dāng)進(jìn)一步水解后，生物價(jià)變化不明顯。蛋白的水解有助于蛋白消化吸收后的利用。

2.5 不同水解度菜籽蛋白對(duì)SD大鼠體重的影響

通過(guò)21 d不同水解度蛋白飼料對(duì)SD大鼠的飼養(yǎng)試驗(yàn)，測(cè)定了不同水解度菜籽蛋白對(duì)大鼠生長(zhǎng)性能的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。所有SD大鼠在試驗(yàn)3周內(nèi)，正常進(jìn)食飲水，排泄物和分泌物沒(méi)有異常，毛色順滑，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的食物中毒現(xiàn)象，也沒(méi)有動(dòng)物異常死亡。

表4顯示了SD大鼠的體重變化，從體重增長(zhǎng)趨勢(shì)來(lái)看，無(wú)氮組由于飼料不含蛋白，大鼠體重隨著試驗(yàn)的進(jìn)行逐漸減少，其他組的大鼠隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，體重增加。在初始體重相差很小的情況下喂食各種飼料，飼養(yǎng)1周后，除了無(wú)氮組，各組體重差異不明顯（P＞0.05）。飼養(yǎng)2周后，與酪蛋白組相比，菜籽蛋白組、DH 4%和DH 8%這3組體重均比酪蛋白組要高（P＜0.05）；DH 16%和DH 20%的組與DH 4%的組比，體重有所降低 （P＜0.05）。飼養(yǎng)3周后，與酪蛋白組相比，菜籽蛋白組、DH 4%和DH 8%的組體重要高，且差異極顯著（P＜0.01），DH 12%的組體重也要高，有顯著性差異（P＜0.05）；與菜籽蛋白組和 DH 4%相比，DH 12%、DH 16%和 DH 20%的體重都要低（P＜0.05）。由以上分析表明，菜籽蛋白組和DH 4%的組大鼠的生長(zhǎng)性能較好，隨著菜籽蛋白水解度的增大，大鼠平均體重有降低的趨勢(shì)。

表2 不同水解度對(duì)菜籽蛋白凈利用率的影響／%

表3 不同水解度對(duì)菜籽蛋白生物價(jià)的影響／%

表4 不同水解度菜籽蛋白對(duì)SD大鼠體重（g）的影響

2.6 水解度對(duì)菜籽蛋白功效比值及凈蛋白比的影響

水解度對(duì)菜籽蛋白功效比值和凈蛋白比的影響結(jié)果如表5所示。蛋白質(zhì)功效比反映出蛋白質(zhì)在體內(nèi)的利用程度及其效率［5］。菜籽蛋白組及DH 4%的組功效比值較高，兩者之間無(wú)明顯區(qū)別；與酪蛋白組及DH 12%、DH 16%和DH 20%的組相比，有顯著性差異（P＜0.05）。對(duì)于凈蛋白比這一指標(biāo)而言，菜籽蛋白組和DH 4%的組與酪蛋白相比，無(wú)顯著差異，跟DH 12%、DH 16%和DH 20%相比，都有顯著差異（P＜0.05）。整體而言，菜籽蛋白水解之后，隨著水解度的增大，其功效比值和凈蛋白比有降低的趨勢(shì)，且在較高水解度時(shí)，如DH 16%和DH 20%，則功效比值和凈蛋白比基本不變。

表5 不同水解度對(duì)菜籽蛋白功效比值和凈蛋白比的影響

3 結(jié)論

本研究在證明各不同蛋白飼料安全無(wú)毒的基礎(chǔ)上，以剛斷乳的SD大鼠為研究對(duì)象，以酪蛋白、未水解菜籽蛋白、無(wú)氮飼料為對(duì)照組，揭示了水解度對(duì)蛋白生物利用度的影響。結(jié)果表明：真消化率、表觀(guān)消化率、凈蛋白比、蛋白功效比值和SD大鼠體重隨水解度的增大有降低的趨勢(shì)；DH 4%的組與菜籽蛋白組相比無(wú)顯著變化（P＞0.05）。菜籽蛋白各水解組的凈利用率要高于菜籽蛋白未水解組，但差異不顯著（P＞0.05）。與菜籽蛋白組相比，DH 4%組的生物價(jià)有顯著的提高（P＜0.05）；而與水解度更高的組相比，生物價(jià)無(wú)顯著變化（P＞0.05）。綜合考慮，說(shuō)明DH 4%的組具有較高的生物利用度，即菜籽蛋白低程度的水解有利于提高其生物利用度。本試驗(yàn)只是研究了不同水解度菜籽蛋白的消化、代謝和吸收規(guī)律，對(duì)于復(fù)雜的形成這些規(guī)律的根本原因有待進(jìn)一步研究。

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The Effect of Hydrolysis Reaction on the Bioavailability of Rapeseed Protein

Luo Min1Ma Haile1，2He Ronghai1Cheng Yu1Zhou Cunshan1Jin Jian1Guo Jingjing1Hao Junjie1
（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University1，Zhenjiang 212013）
（Jiangsu Provincial Key Laboratory for Physical Processing of Agricultural Products2，Zhenjiang 212013）

The effect of enzymolysis on bioavailability of rapeseed protein was studied in the paper.Total 64 male Sprague-Dawley（SD）ratswere selected and divided into 8 groups as protein-free group，control group（casein group），rapeseed protein group and 5 hydrolysate groupswith DH of4%，8%，12%，16%and 20%，respectively.Feed protein-free diet concurrently with test diets，in duplicate for 3-day preliminary period and 5-day balance period respectively，the apparent digestibility（AD），true digestibility（TD），net protein utilization rate（NPUR）and biological value（BV）was determined.Protein efficiency ratio（PER）and net protein ratio（NPR）were studied by calculation of theweight gain and feed consumed.The animal test revealed that AD，TD，PER associated with NPR at higher DH had a relatively lower value.The DH of 4%group showed no significant difference compared with the rapeseed protein group（P＞0.05）.The NPUR value of protein hydrolysate groups were higher than that of the rapeseed protein group，but there was no significant difference（P＞0.05）.The BV of DH of 4%group was significantly different from the rapeseed protein group（P＜0.05）and demonstrated little change compared with the higher DH groups（P＞0.05）.The results indicated that the DH of4%group had a higher bioavailability，which could be a good protein resource for the human.

rapeseed protein，hydrolysis reaction，hydrolysis degree，bioavailability

Q519

A

1003-0174（2015）07-0023-05

863計(jì)劃（2013AA102203）

2014-01-26

羅敏，女，1989年出生，碩士，高生物利用度蛋白的制備

馬海樂(lè)，男，1963年出生，教授，食品生物技術(shù)以及生物能源