鞏偉 李興東 孫旭 趙慶華 張欣欣 張琨 趙梅

濟(jì)南軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗所，山東濟(jì)南250022

藍(lán)翹解毒口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的改進(jìn)

鞏偉 李興東 孫旭 趙慶華 張欣欣 張琨 趙梅

濟(jì)南軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗所，山東濟(jì)南250022

目的對藍(lán)翹解毒口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行改進(jìn)。方法采用薄層色譜法（TLC）鑒別制劑中的板藍(lán)根，氣相色譜法（GC）鑒別制劑中的廣藿香，高效液相色譜法（HPLC）測定制劑中連翹苷的含量。結(jié)果TLC法鑒別供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點；GC法檢測供試品色譜中呈現(xiàn)與對照品色譜峰保留時間相同的色譜峰；HPLC法含量測定中連翹苷在9.387～300.4μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9999，n=6），加樣回收率為99.62%，RSD為1.21%（n=9）。結(jié)論本研究建立的方法結(jié)果準(zhǔn)確，穩(wěn)定性好，專屬性強(qiáng)，改進(jìn)后的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可用于藍(lán)翹解毒口服液的質(zhì)量控制。

藍(lán)翹解毒口服液曰薄層色譜法曰氣相色譜法曰高效液相色譜法曰板藍(lán)根曰廣藿香曰連翹苷

藍(lán)翹解毒口服液為《解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》2002年版收載品種［1］，臨床用于預(yù)防和治療病毒性感冒、病毒性腦炎等。該藥處方由板藍(lán)根、蘆根、山豆根、郁金、連翹、石膏、石菖蒲、廣藿香、荊芥、地黃、知母等11味中藥組成。該藥原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有針對山豆根和連翹的薄層色譜鑒別等檢驗項目，無含量測定。在軍隊醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高工作展開之際，為更有效地控制藍(lán)翹解毒口服液的質(zhì)量，本試驗對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提高，其中采用薄層色譜法（TLC）對板藍(lán)根進(jìn)行定性分析，氣相色譜法（GC）法對廣藿香進(jìn)行定性分析，高效液相色譜法（HPLC）對連翹進(jìn)行定量分析，現(xiàn)報道如下：

1 儀器與試藥

1.1 儀器

GC2010氣相色譜儀（日本島津公司）；LC-20AT液相色譜儀（日本島津公司）；AUW220D電子分析天平（日本島津公司）；Synergy-UV超純水器（法國Millipore公司）；TLA-1薄層觀察分析儀（湖南長沙克羅瑪科技有限公司）。

1.2 試藥

板藍(lán)根對照藥材（批號：121177-201105），亮氨酸對照品（批號：140687-200401），精氨酸對照品（批號：140685-201003），百秋李醇對照品（批號：110772-201105），連翹苷對照品（批號：110821-201112，含量測定以95.3%計算），以上標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購自中國藥品生物制品檢定研究院；乙腈、萘為色譜純（Honeywell），水為自制超純水，硅膠G薄層板購自煙臺市化學(xué)工業(yè)研究所（批號：120924），其他試劑均為分析純。藍(lán)翹解毒口服液為濟(jì)南軍區(qū)聯(lián)勤部2014年度抽驗制劑品種（規(guī)格每支裝10 mL，批號：20140108、20140224、20140128、20130923，生產(chǎn)單位分別為解放軍第一五四醫(yī)院、第一五五醫(yī)院、第一五九醫(yī)院、第三七一醫(yī)院，陰性對照制劑委托解放軍第三七一醫(yī)院配制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC法行板藍(lán)根定性分析

取本品10 mL，蒸干，殘渣加稀乙醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取缺板藍(lán)根的陰性對照制劑10 mL，同法制成陰性對照溶液。另取板藍(lán)根對照藥材1.0 g，加稀乙醇20 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加稀乙醇2 mL使溶解，制成對照藥材溶液。再取亮氨酸對照品、精氨酸對照品適量，加稀乙醇制成每1毫升各含0.5 mg的混合溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法［2］附錄34-35試驗，吸取上述3種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（19∶5∶5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茚三酮試液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上應(yīng)顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。薄層色譜圖見圖1。

圖1 板藍(lán)根鑒別薄層色譜圖

2.2 GC法行廣藿香定性分析

取本品100 mL，置500 mL圓底燒瓶中，加水100 mL與玻璃珠數(shù)粒，連接揮發(fā)油測定器，自測定器上端加水使充滿刻度部分，并溢流入燒瓶為止，再加入環(huán)已烷2 mL，連接回流冷凝管，加熱回流2 h，冷卻，取環(huán)已烷液，加入適量無水硫酸鈉，振搖，取上清液作為供試品溶液。另取缺廣藿香的陰性對照制劑100 mL，同法制備陰性對照溶液。另取百秋李醇對照品適量，加環(huán)已烷制成每l毫升含0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。照氣相色譜法［2］附錄38-39試驗，用以5%苯基甲基聚硅氧烷為固定相的毛細(xì)管柱（柱長為30 m，內(nèi)徑為0.32 mm，膜厚度為0.25μm）；柱溫為程序升溫：初始溫度170℃，以每分鐘2℃的速率升溫至180℃，保持2 min，再以每分鐘10℃的速率升溫至230℃，保持2 min；進(jìn)樣口溫度為230℃；檢測器溫度為250℃；分流進(jìn)樣，分流比為50∶1。分別吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各1μL，注入氣相色譜儀。供試品色譜中應(yīng)呈現(xiàn)與對照品色譜峰保留時間相同的色譜峰，陰性對照無干擾。氣相色譜圖見圖2。

圖2 廣藿香鑒別氣相色譜圖

2.3 HPLC法行連翹定量分析

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS3柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-水（23∶77），流速：1.0 mL/min；檢測波長：277 nm；柱溫為室溫；自動進(jìn)樣器進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10μL；理論板數(shù)按連翹苷峰計應(yīng)不低于5000，陰性對照無干擾。液相色譜圖見圖3。

2.3.2 溶液的制備

2.3.2.1 對照品溶液的制備精密稱取連翹苷對照品19.70 mg，置25 mL量瓶中，加70%甲醇定容，搖勻，作為對照品貯備液。精密量取對照品貯備液適量，以70%甲醇為溶劑制成不同質(zhì)量濃度的對照品溶液。該系列的連翹苷對照品溶液的最終質(zhì)量濃度分別為9.387、18.77、37.55、75.10、150.2、300.4μg/mL。

2.3.2.2 供試品溶液的制備精密量取本品25 mL，用乙酸乙酯振搖提取6次，每次25 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加70%甲醇溶解，置10 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3.2.3 陰性對照溶液的制備另取缺連翹的陰性對照制劑25 mL，同法制備陰性對照溶液。

2.3.3 線性關(guān)系考察

取“2.3.2”項下配制的系列對照品溶液各10μL，注入液相色譜儀進(jìn)行測定。以質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得連翹苷的回歸方程為Y=456.8X-19.27（r=0.9999，n=6）。結(jié)果表明，連翹苷在9.387～300.4μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4 精密度試驗

精密吸取同一對照品溶液（質(zhì)量濃度為75.10μg/mL），連續(xù)進(jìn)樣6次，連翹苷峰峰面積的RSD為0.82%（n= 6），表明精密度良好。

圖3 連翹苷含量測定高效液相色譜圖

2.3.5 重復(fù)性試驗

取藍(lán)翹解毒口服液（批號：20130923）25 mL，按“2.3.2”項下方法制備，平行試驗6份。結(jié)果連翹苷的平均含量為97.28μg/mL，RSD=0.88%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液10μL，于0、4、8、12、16、24h分別測定峰面積。結(jié)果，連翹苷峰面積的RSD為1.15%（n=6），表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗

精密量取已知連翹苷含量的樣品（批號：20130923，含量為97.28μg/mL）9份，分別按低、中、高加入連翹苷對照品，按“2.3.2”項下方法制備，測定峰面積并計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n=9）

2.3.8 樣品含量測定

取4批藍(lán)翹解毒口服液，按“2.3.2”項下方法制備并測定連翹苷的含量，測定結(jié)果見表2。

表2 連翹苷含量測定結(jié)果（n=2）

3 討論

該制劑處方中，板藍(lán)根［2］191苦寒清泄，擅清熱解毒，更擅涼血利咽，直折里熱，連翹［2］159-160性苦微寒，善清降之中兼能升浮宣散，能表里氣血俱清，二者共為君藥，同行清熱解毒，涼血消腫之功；山豆根［2］25-26性苦寒，功專清泄，廣藿香［2］42-43辛散溫運，芳香化濁，兩者一泄一發(fā)，相須為用，更助君藥之力，共為臣藥。根據(jù)《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)（中藥）研究制定技術(shù)要求》［3］，應(yīng)對上述4味藥進(jìn)行定性定量分析。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有針對山豆根和連翹的薄層色譜鑒別，無含量測定，本試驗在其基礎(chǔ)上，擬增加針對板藍(lán)根和廣藿香的定性分析，增加針對連翹的定量分析。

3.1 板藍(lán)根的定性鑒別

現(xiàn)代研究表明，板藍(lán)根化學(xué)成分豐富［4］，抗病毒作用明顯［5-8］，臨床應(yīng)用廣泛［9］。其中，亮氨酸、精氨酸等氨基酸類成分為板藍(lán)根的重要藥理活性成分，含量可達(dá)8%［10］。本試驗通過TLC法對板藍(lán)根進(jìn)行鑒別［11］，方法參照《中國藥典》2010年版一部板藍(lán)根鑒別項下方法進(jìn)行［2］191。原方法對照溶液選用板藍(lán)根對照藥材、精氨酸對照品，本試驗在此基礎(chǔ)上增加了亮氨酸對照品，斑點顯色清晰，色譜分離效果良好，操作方便，專屬性強(qiáng)，可以有效對之進(jìn)行鑒別。

3.2 廣藿香的定性鑒別

廣藿香的藥用成分主要是揮發(fā)油，廣藿香油中含有較多的醇類、酮類、醛類等化合物，其中百秋李醇是其代表性活性成分［12-13］。本試驗通過GC法檢測制劑中的百秋李醇［14］，從而對廣藿香進(jìn)行鑒別。試驗中，首先通過揮發(fā)油測定法制備揮發(fā)油，然后通過GC法鑒別揮發(fā)油中的有效成分百秋李醇。GC法檢測靈敏度高，專屬性強(qiáng)，可以有效地對廣藿香進(jìn)行鑒別。

3.3 連翹苷的定量分析

連翹苷為連翹的主要有效成分之一［15］，結(jié)合文獻(xiàn)報道［16-17］，本試驗采用HPLC法測定制劑中連翹苷的含量。

制備供試品溶液時，通過乙酸乙酯萃取，可以有效除去制劑中的干擾成分，提高連翹苷的提取率。測定波長、流動相、提取溶劑均參照《中國藥典》2010年版一部［2］159-160。選擇色譜柱時，考察了Agilentzorbaxextend C18（4.6mm×150mm，5μm）、ShimadzuVP-ODS色譜（150mm×4.6mm，5μm）、InertsilODS3（250mm× 4.6mm，5μm）、KromasilKR100-5-C18（150mm×4.6mm，5μm）等4種色譜柱，結(jié)果表明4種色譜柱的峰形、理論板數(shù)、分離度均良好，無顯著性差異，最終選擇InertsilODS3（250mm×4.6mm，5μm）進(jìn)行方法學(xué)考察和樣品含量測定。

根據(jù)《中國藥典》中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則的要求［2］附錄130-131，含量限（幅）度的制訂，應(yīng)根據(jù)投料飲片、中間體轉(zhuǎn)移率的實際情況確定。本次測定了4批藍(lán)翹解毒口服液中連翹苷的含量，其值分別為90.06、82.94、85.24、97.28μg/mL，平均值為88.88μg/mL，上述數(shù)據(jù)為藍(lán)翹解毒口服液中連翹苷的含量限度的確定提供了參考。HPLC法測定結(jié)果準(zhǔn)確，穩(wěn)定性好，專屬性強(qiáng)，可以有效測定制劑中連翹苷的含量。

綜上所述，本試驗對藍(lán)翹解毒口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了提高，其中TLC法鑒別板藍(lán)根操作方便、專屬性強(qiáng)，GC法鑒別廣藿香靈敏度高、專屬性強(qiáng)，HPLC法測定連翹苷的含量結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好，可以用于藍(lán)翹解毒口服液的質(zhì)量控制。因此，可將板藍(lán)根的TLC鑒別、廣藿香的GC鑒別、連翹苷的含量測定列入藍(lán)翹解毒口服液的原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，從而對其進(jìn)行提高。

［1］解放軍總后勤部衛(wèi)生部.中國人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范［S］.北京：人民軍醫(yī)出版社，2002：40-41.

［2］國家藥典委員會.中國藥典［S］.一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

［3］國家藥典委員會.國家藥品標(biāo)準(zhǔn)工作手冊［M］.4版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2013：3-17.

［4］孫巍.板藍(lán)根的化學(xué)成分和藥理作用綜述［J］.中國醫(yī)藥指南，2014，12（9）：35-36.

［5］李莉，楊子峰.板藍(lán)根抗流感病毒多靶點研究思路綜述［J］.新中醫(yī)，2014，46（3）：202-204.

［6］劉西京，林素靜.板藍(lán)根多肽對流感病毒感染小鼠抗病毒作用的研究［J］.中國藥房，2014，25（7）：590-592.

［7］陳凱，竇月，陳智，等.板藍(lán)根抗病毒與抗內(nèi)毒素等清熱解毒藥效作用及化學(xué)基礎(chǔ)研究進(jìn)展［J］.中國方劑學(xué)雜志，2011，17（18）：275-278.

［8］Xie Z，ShiY，Wang Z，etal.Biotransformation ofglucosinolates epiprogoitrin and progoitrin to（R）-and（S）-Goitrin in Radix isatidis［J］.J Agric Food Chem，2011，59（23）：12467-12472.

［9］劉建順.板藍(lán)根中成藥臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展［J］.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2013，7（17）：222.

［10］任國萍，田璐，李錚，等.板藍(lán)根藥材中氨基酸含量測定研究［J］.中國新藥雜志，2014，23（1）：99-104.

［11］王斌，張騰霄，劉利軍，等.國內(nèi)板藍(lán)根藥材質(zhì)量評價方法的研究現(xiàn)狀［J］.貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，35（2）：31-33.

［12］安茜，謝紅，王瑋，等.廣藿香質(zhì)量控制研究進(jìn)展［J］.武警后勤學(xué)院學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2013，22（11）：1046-1048.

［13］梅清華，陳燕，蘭樹敏，等.廣藿香抑制腸推進(jìn)藥效指紋圖譜構(gòu)建與譜效關(guān)系研究［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2013，10（35）：17-20.

［14］康志英，蔡春玲，連林生，等.抗病毒口服液中廣藿香含量測定方法研究［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，8（2）：55-57.

［15］陳玲，李曉，李倩，等.連翹屬植物化學(xué)成分的研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2013，28（3）：184-188.

［16］張宏偉，龔韜，嚴(yán)文利，等.高效液相色譜法測定不同廠家銀翹解毒片中連翹酯A的含量［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2013，10（6）：102-104.

［17］李延雪，孫菲，邵禮梅.HPLC法測定復(fù)方芩蘭口服液中連翹苷的含量［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2012，9（26）：117-118.

Study on the quality standard improve of Lanqiao Jiedu Oral Liquid

GONG Wei LI Xingdong SUN Xu ZHAO Qinghua ZHA NG Xinxin ZHANG Kun ZHA O Mei
Institute for Drug and Instrument Control,Joint Logistics Department of Ji'nan Military Command,Shandong Province, Ji＇nan 250022,China

ObjectiveTo improve the quality standard of Lanqiao Jiedu Oral Liquid.MethodsIsatidis radix in the prescription was identified by TLC,while Pogostemonis herba in the prescription was identified by GC.The content of Phillyrin,which derived from Forsythiae fructus,was determined by HPLC.ResultsThe spots in the chromatogram obtained with test solution correspond in position and colour to the spots obtained with the reference drug solution and the reference solution in the TLC test.The retention time of the peaks obtained with the test solution and the reference solution was concordant with each other in the GC test.Phillyrin showed a good linear relationship at 9.387-300.4μg/mL (r=0.9999,n=6)with average recovery of 99.62%(RSD=1.21%,n=9).ConclusionTLC has obvious characteristics with the spots clear and well-separated for Isatidis radix identification.GC has highly sensitive and good specificity for Pogostemonis herba identification.The HPLC method is easy and simple to operate,accurate and stable in results with good specificity.Above all,the improved quality standard is applicable for the quality control of Lanqiao Jiedu O-ral Liquid.

Lanqiao Jiedu Oral Liquid;TLC;GC;HPLC;Isatidis radix;Pogostemonis herba;Phillyrin

R927.2

A

1673-7210淵2015冤01淵c冤-0095-05

2014-10-03本文編輯：衛(wèi)軻）

軍隊醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高科研專項課題（編號14ZJZ01-2）。

鞏偉（1980-），男，博士；研究方向：藥品質(zhì)量分析。