蔣秋香 吳柳春 韋永樸

【摘要】目的：利用雙波長高效液相色譜法，建立偏癱口服液中阿魏酸、丹酚酸B的含量測定方法。方法：采用雙波長HPLC法，Waters SunFire C18（4.6mm（250mm，5μm）色譜柱，柱溫35℃;甲醇-01%磷酸溶液為流動相，以10mL·min-1流速梯度洗脫;阿魏酸檢測波長為318nm、丹酚酸B檢測波長為286nm。結(jié)果：根據(jù)回歸方程，阿魏酸和丹酚酸B的線性范圍分別為6152～769μg（r=09998）、2948～36850μg（r=10000）;加樣回收率分別為997%（n=6）、 982%（n=6）。結(jié)論：本方法操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可有效地提高該制劑的內(nèi)在質(zhì)量，也為該藥品標(biāo)準(zhǔn)進一步研究，提供一個準(zhǔn)確的參考方法。

【關(guān)鍵詞】 HPLC;梯度洗脫法;偏癱口服液;阿魏酸;丹酚酸B

【中圖分類號】R2841【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2014）01-0007-03

HPLC with dual-wavelength simultaneous determination of two effective ingredients

in Piantan oral liquid by gradient elution

JIANG Qiuxiang ?WU Liuchun ?Wei Yongpu

Guangxi Liuzhou Institate for Food and Drug Control，Liuzhou 545006，China

Abstract： To establish an HPLC with dual-wavelength detection method for simultaneous determination of Ferulic acid and Salvianolic acid B in Piantan oral liquid. Methods： The quantitative analysis was carried out on a column of Waters SunFire C18（46 mm×250 mm，5 μm） by HPLC with dual-wavelength ， by a gradient elution using methanol（A） and water（B） as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL·min-1 at 35 ℃;The eluate was detected by multiple wavelength： 318 nm for Ferulic acid （0～30min），286 nm for Salvianolic acid B （30～50 min）. Results：The linear ranges of Ferulic acid and Salvianolic acid B fell within the ranges of 6152～769μg（r=09998） and 2948～36850μg（r=10000）; The average recoveries were 997%（n=6） for Ferulic acid and 982%（ n=6） for Salvianolic acid B.Conclusion： This method is simple， accurate， reliable and can be use to improve inner quality，also provides a reference standard for the quality control of Piantan oral liquid.

Keywords：Piantan oral liquid; Ferulic acid; Salvianolic acid B

偏癱口服液由地龍、丹參、紅花、川芎、王不留行和甘草六味中藥組成，具有活血、驅(qū)風(fēng)通絡(luò)的作用，是廣西柳州市中醫(yī)院用于治療偏癱的常用院內(nèi)制劑?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)比較簡單，僅檢查藥品性狀、鑒別、相對密度及pH值等，無含量測定項目。方中丹參和川芎屬活血化瘀藥，丹參具有活血祛瘀，養(yǎng)血安神，涼血消腫的功效[1]，現(xiàn)代藥理研究其具有抗血栓、改善微循環(huán)、促進組織的修復(fù)與再生等作用[2];川芎具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效[1]，現(xiàn)代藥理研究其具有擴張血管、抗血栓、改善微循環(huán)等作用[3]。為此，以方中丹參有效成分丹酚酸B、川芎有效成分阿魏酸為指標(biāo)成分，針對其不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，首次采用多波長高效液相色譜法，同時檢測阿魏酸、丹酚酸B的含量。

1儀器與試藥

11儀器Waters 2695型高效液相色譜儀，2487型紫外檢測器，Empower Pro工作站（Waters公司）;UV-2450紫外分光光度計（日本島津公司）;METTLER XS205電子分析天平（瑞士梅特勒公司）。

12試藥對照品阿魏酸（批號：110773-200611）、丹酚酸B（批號：110861-200808）購自中國藥品生物制品檢定所。甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。偏癱口服液樣品3批（規(guī)格為10ml/瓶，批號20101129;20101223;20110228），由廣西柳州市中醫(yī)院制劑室提供，陰性樣品按偏癱口服液處方比例自配。

2實驗方法與結(jié)果

21色譜條件色譜柱：Waters SunFire C18（46 mm（250 mm，5 μm），柱溫35℃;以甲醇（A）和01%磷酸溶液（B）為流動相，梯度洗脫。0～22min甲醇的比例為30%;22～25min甲醇的比例為30%～40%;25～53min甲醇的比例為40%。流速10ml·min-1;阿魏酸檢、丹酚酸B檢測波長為分別318nm（0～30min）、286nm（30～53min）;進樣量為10μl。按上述實驗條件進行測定，結(jié)果理論板數(shù)以2種指標(biāo)成分（阿魏酸、丹酚酸B）計均不低于5000，且2種成分都能達(dá)到基線分離，分離度大于15。

22溶液的制備

221混合對照品溶液制備分別取對照品阿魏酸、丹酚酸B適量，精密稱定，加甲醇制成含阿魏酸0003mg·ml-1、丹酚酸B 015mg·ml-1的混合溶液，即得。

222供試品溶液取偏癱口服液樣品過045μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

223陰性供試品溶液取缺川芎的陰性樣品和缺丹參的陰性樣品，分別過045μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

23專屬性試驗分別取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性供試品溶液各10μl，按上述色譜條件進樣，液相色譜圖見圖1。陰性樣品在阿魏酸、丹酚酸B的色譜峰位置上無吸收，表明該方法的專屬性良好。

24線性關(guān)系考察分別精密吸取“221”項下混合對照品溶液2、5、10、15、20、25μL進樣分析，記錄峰面積。以峰面積Y對進樣量X（μg）進行線性回歸，求得阿魏酸和丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程、相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表1。

表1阿魏酸和丹酚酸B的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

成 分 ? 回歸方程相關(guān)系數(shù) 線性范圍（μg）

阿魏酸（ Ferulic acid ）Y =548×103 X -156×104099986152～7690

丹酚酸B（ Salvianolic acid B） Y =123×103 X -569×104099992948～3685

25精密度試驗精密吸取混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，每次10μl，以阿魏酸、丹酚酸B峰面積計，RSD分別為09%，15%。表明該方法精密度良好。

26穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液，室溫下分別于0、2、8、12、20、24h進樣測定，考察阿魏酸、丹酚酸B在室溫下的溶液穩(wěn)定性，記錄色譜圖，以峰面積進行計算，結(jié)果RSD分別為10%、22%。表明供試品溶液室溫放置24h內(nèi)保持穩(wěn)定。

27重復(fù)性試驗取同一樣品各6份，分別按“222”項下方法制備供試品溶液，進樣10μl，測定。結(jié)果樣品中阿魏酸和丹酚酸B平均含量（n=6）分別為2635μg·ml-1，1288μg·ml-1;RSD分別為12%，15%。表明該方法重復(fù)性良好。

28回收率試驗精密吸取“27”項下已知阿魏酸、丹酚酸B含量的樣品5ml共6份，分別精密加入“221項下的對照品混合溶液（阿魏酸3076μg·ml-1、丹酚酸B1474μg·ml-1）5ml，按“222”項下方法操作，制備供試溶液，測定，計算回收率。結(jié)果阿魏酸和丹酚酸B的平均回收率（n=6）分別為997%（RSD=16%），982%（RSD=09%）。

29樣品含量測定分別取3個批號的偏癱口服液樣品，按“222”項下制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液及混合對照品溶液各10μl，注入液相色譜儀，進行測定，按外標(biāo)法計算含量，結(jié)果見表2。

表2偏癱口服液中阿魏酸和丹酚酸B的含量（μg·ml-1）

批 ?號 阿魏酸 丹酚酸B

20101129 ? 2635 1288

20101223 ? 4453 2182

20110228 ? 3096 2407

4討論

41檢測波長的選擇經(jīng)紫外分光光度計掃描波長，阿魏酸、丹酚酸B分別在318nm、286nm處有最大吸收，與2010年版中國藥典一部川芎（阿魏酸）、丹參（丹酚酸B）的含量測定檢測波長分別為321nm、286nm相符合。在試驗中選擇同時兼顧到2個被測成分在某單一波長下檢測，結(jié)果大大降低了被測成分的檢測靈敏度，甚至造成被測成分未檢出的后果。故本文采用多波長測定法，分別在各被測成分紫外最大吸收波長處同時進行含量檢測。這樣既提高了檢測靈敏度，又為測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠提供保障。

42流動相的選擇參考中國藥典及文獻(xiàn)資料[4-5]，綜合幾種流動相方法分析，得出本實驗流動相條件。結(jié)果表明采用本實驗所采用的梯度洗脫方法，能較好的分離有效成分，且分離時間短，峰形好。

43供試品溶液的制備樣品無需任何前處理，直接過濾膜即可進樣分析。既操作簡便，利于生產(chǎn)廠家半成品及成品快速檢測，又消除了分析環(huán)節(jié)的一大誤差因素。

參考文獻(xiàn)

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M]：2010年版一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2] 羅彩蓮.丹參的藥理作用與臨床應(yīng)用[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2012，19（12）：11-12.

[3] 裴艷霞.川芎的藥理作用及臨床應(yīng)用[J].中國醫(yī)藥指南，2011，9（34）：197-198.

[4] 劉建明，郭詠梅，周娟麗.HPLC法測定新生化顆粒中阿魏酸的含量[J].宜春學(xué)院學(xué)報，2012，3（4）：111-112.

[5] 于晶晶，徐飛鶴.RP-HPLC同時測定香丹注射液中丹參素鈉、原兒茶醛和丹酚酸B的含量[J].海峽藥學(xué)，2012，2（2）：45-47.

（收稿日期：20131115）