吳青青，胡小京，黃 偉*，楊雪蓮，夏景風(fēng)，魯 周

(1.貴州省園藝研究所，貴州貴陽(yáng) 550006；2.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550006)

流式細(xì)胞儀測(cè)定百合花粉倍性的研究

吳青青1，胡小京2，黃 偉1*，楊雪蓮2，夏景風(fēng)2，魯 周1

(1.貴州省園藝研究所，貴州貴陽(yáng) 550006；2.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550006)

[目的]為利用百合未減數(shù)花粉進(jìn)行有性多倍化育種。[方法] 利用流式細(xì)胞儀測(cè)定百合花粉的倍性，以Marlon、Viviana的花粉為材料，以葉片為對(duì)照，比較兩種不同細(xì)胞核提取液的效果差異。[結(jié)果] CyStain UV Precise T提取液明顯優(yōu)于WPB提取液；Marlon、Vivian葉片測(cè)定結(jié)果顯示其為二倍體，花粉測(cè)定的圖像顯示兩個(gè)品種都能自發(fā)產(chǎn)生2n花粉。[結(jié)論] 流式細(xì)胞儀可以快速地測(cè)定百合花粉的倍性。

流式細(xì)胞儀；百合；花粉；倍性

百合為百合科百合屬多年生球根花卉，性喜高原山地冷涼氣候。野生種在我國(guó)云貴高原等海拔2 000 m左右地區(qū)廣泛分布，其切花商業(yè)品種也多種植于海拔2 300 m左右的地區(qū)。

百合商業(yè)品種是全球花卉市場(chǎng)主流切花之一，受到歐美、亞洲消費(fèi)者的廣泛喜愛(ài)，具有廣闊的市場(chǎng)。百合商業(yè)品種有高度雜合性，染色體同源性較差。這些雜交種通常都會(huì)自發(fā)地產(chǎn)生未減數(shù)花粉。這些花粉很多能夠正常萌發(fā)，可以作為有性多倍化育種的材料，用于雜交授粉[1-5]。

流式細(xì)胞技術(shù)(Flow cytometry)是20世紀(jì)80年代興起的新技術(shù)，有快速、簡(jiǎn)單、通量大的特點(diǎn)，被廣泛地用于基礎(chǔ)研究。流式細(xì)胞儀常被用于鑒定植物的倍性，通過(guò)檢測(cè)植株G0/G1峰的核酸含量可以判斷出植物的倍性[6-13]。將流式細(xì)胞儀用于百合花粉倍性的檢測(cè)，可以快速地知道某一品種是否能產(chǎn)生未減數(shù)花粉，之后則可以通過(guò)一些技術(shù)手段對(duì)花粉進(jìn)行分離，篩選出未減數(shù)花粉用于雜交授粉。百合花粉一般為橢圓形，長(zhǎng)徑在100 μm左右，體積微小，花粉壁較厚，將之破碎后釋放出足夠量的游離細(xì)胞核用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)較困難。筆者借鑒了同行經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)出適合的方法，能夠較方便地制備百合花粉細(xì)胞核懸浮液，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料供試材料為2個(gè)百合商業(yè)品種Marlon、Viviana花粉，以各自葉片為對(duì)照。所有材料均種植于貴州省園藝研究所花卉大棚。流式細(xì)胞儀為Partec公司生產(chǎn)CyFlow Space，染色液為Partec公司生產(chǎn)的CyStain UV Ploidy DAPI Staining Solution。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1樣品采集。采集葉片，放入冰盒中帶回試驗(yàn)室，清洗干凈后晾干，備用；在百合花朵完全綻放后，用小塑料袋收集已成熟的花粉，做好標(biāo)記，并帶回試驗(yàn)室，然后將花粉平鋪在培養(yǎng)皿中，放在30 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)保存，備用。

1.2.2細(xì)胞核的提取和染色。使用WPB(Woody Plant Buffer)和CyStanin UV Precise T兩種提取液制備Marlon葉片細(xì)胞核懸浮液，比較試驗(yàn)效果。CyStain UV Precise T購(gòu)自于Partec公司；WPB含濃度1% PVP-10、0.2 mol/L Tris-HCl、2 mmol/L Na2EDTA、4 mmol/L MgCl2、10 mmol/L Sodium metabisulfite、86 mmol/L NaCl、1%(V/V)Triton X-100，pH 7.5[14]。

1.2.3葉片細(xì)胞核懸浮液制備方法。在6 cm玻璃培養(yǎng)皿中加入0.5 cm*0.5 cm大小鮮嫩葉片，滴加400 μl細(xì)胞核提取液浸沒(méi)樣品，用鋒利刀片切碎葉片至糊狀加入2 ml染色液染色后，30 μm篩網(wǎng)過(guò)濾，上機(jī)測(cè)定。

1.2.4花粉細(xì)胞核懸浮液制備方法。在6 cm玻璃培養(yǎng)皿中加入大量花粉，最好為干燥過(guò)的花朵，滴加400 μl的CyStanin UV Precise T細(xì)胞核提取液浸沒(méi)樣品，攪拌均勻后靜置5～20 min，待成糊狀后用鋒利刀片反復(fù)砍切20 min，加入2 ml染色液染色后，30 μm篩網(wǎng)過(guò)濾，上機(jī)測(cè)定。同時(shí)，可斟量添加染色液以保證細(xì)胞核濃度。

1.2.5流式細(xì)胞儀倍性測(cè)定。DAPI染色的雙鏈核酸在365 nm的激光下激發(fā)放出藍(lán)色熒光，設(shè)置增益電壓為268，上樣測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞核提取液對(duì)倍性測(cè)定的影響利用兩種不同的提取液處理Marlon葉片，得到細(xì)胞核懸浮液。加入染色液染色后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。由圖1、2可知，在由WPB提取液得到的圖像上能夠看到G0/G1峰，但并不明顯，細(xì)胞碎片較多，對(duì)G0/G1峰的下部有所掩蓋；在用CyStain UV Precise T提取液得到的圖像上G0/G1峰清晰，細(xì)胞碎片相對(duì)較少，試驗(yàn)效果明顯優(yōu)于WPB提取液。

2.2 葉片倍性的測(cè)定Marlon、Viviana葉片利用CyStain UV Precise T提取液制備細(xì)胞核懸浮液，上機(jī)測(cè)定，以此作為花粉倍性測(cè)定的對(duì)照。由圖1、3可知，兩個(gè)百合品種都是二倍體，GO/G1峰在橫坐標(biāo)100左側(cè)，Marlon GO/G1峰的橫坐標(biāo)平均數(shù)為84.65，CV值為9.88%，Viviana為80.51，CV值為11.13%。Marlon為OT遠(yuǎn)緣雜交種，Viviana為O雜交種，都是近幾年剛培育出的新品種。

2.3 花粉倍性的測(cè)定利用CyStain UV Precise T提取液制備花粉細(xì)胞核懸浮液，上機(jī)檢測(cè)。由圖4、5可知，除了單倍體峰，在兩份花粉中都檢測(cè)出二倍體峰。百合為二細(xì)胞花粉，包含一個(gè)大的單倍體營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和一個(gè)小的單倍體生殖細(xì)胞，在經(jīng)過(guò)花粉破碎、細(xì)胞核提取液的裂解以及30 μm篩網(wǎng)過(guò)濾之后基本得到的懸浮液都應(yīng)該是單一的細(xì)胞核和較小的細(xì)胞碎片，此時(shí)出現(xiàn)的二倍體峰應(yīng)該為2n花粉細(xì)胞核所產(chǎn)生的信號(hào)，也就是說(shuō)，這兩個(gè)品種都可以自發(fā)地產(chǎn)生2n配子。據(jù)圖像，發(fā)現(xiàn)Marlon花粉單倍體峰的橫坐標(biāo)平均數(shù)為49.52，CV值為7.83%，二倍體峰為92.03，CV值為12.29%；Viviana為單倍體峰為38.90，CV值為8.51%，二倍體峰為72.46，CV值為8.17%。CV值表示取樣的異質(zhì)性，CV值越高則表示取樣同質(zhì)性差。

Marlon花粉二倍體峰底部向橫坐標(biāo)右側(cè)有延伸。這部分可能是雜質(zhì)信號(hào)，也可能是其他倍性的花粉細(xì)胞核信號(hào)，影響二倍體峰的分析數(shù)據(jù)，使得平均值大于二倍體葉片的數(shù)值，但從主峰的位置上來(lái)看與葉片的GO/G1峰是吻合的。

Viviana的二倍體峰平均值則略小于葉片數(shù)值。這是由二倍體峰和單倍體峰之間的細(xì)胞核信號(hào)較多造成的。這些信號(hào)可能是由非整倍體花粉造成的。單獨(dú)取出Viviana的二倍體主峰進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)平均值為82.89，CV值為24.02%，其數(shù)值基本與二倍體葉片相當(dāng)。

圖1 CyStain UV Precise T 處理Marlon葉片

圖2 WPB處理Marlon葉片

圖3 CyStain UV Precise T 處理Viviana葉片

3 討論

百合花粉較難破碎。如何有效地破碎花粉壁是保證試驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵問(wèn)題。在試驗(yàn)初期階段，筆者嘗試了液氮、砂紙、離心等手段，但效果都不好，最后還是采用刀片砍切的辦法，操作簡(jiǎn)單，但是比較費(fèi)力，需連續(xù)20 min才能保證較好的破碎量，花粉需求量也較大。

對(duì)于葉片雜質(zhì)問(wèn)題，在制備葉片細(xì)胞核懸浮液的過(guò)程中，需要將葉片破碎至糊狀，才能保證懸浮液有合適的細(xì)胞核濃度，造成懸浮液中細(xì)胞碎片較多。研究表明，在GO/G1峰左側(cè)能夠看到大量明顯的雜質(zhì)信號(hào)。這些雜質(zhì)信號(hào)在進(jìn)行分析時(shí)會(huì)影響數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，需要對(duì)其進(jìn)行遮擋。

對(duì)于流速與密度問(wèn)題，在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)流式細(xì)胞儀的檢測(cè)能力是有限的，在每秒通過(guò)信號(hào)數(shù)超過(guò)一定值的情況下，檢測(cè)到的信號(hào)會(huì)被削弱。比如，在相同上樣流速的情況下，信號(hào)密度為30個(gè)/s，峰所在的位置橫坐標(biāo)值為85，如果信號(hào)密度達(dá)到350個(gè)/s，那么峰所在的位置橫坐標(biāo)值會(huì)降低到55?？紤]到這種情況，筆者對(duì)樣品濃度和上樣流速都提出要求。如果樣品濃度過(guò)高，則很可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，同理在高流速下，單位時(shí)間經(jīng)過(guò)的樣品數(shù)量過(guò)高，就等同于提高檢測(cè)樣品的濃度，必然也會(huì)影響熒光信號(hào)的數(shù)值。這個(gè)問(wèn)題根源還是由于流式細(xì)胞儀的檢測(cè)能力有限。

圖4 Marlon花粉圖像

圖5 Viviana花粉圖像

[1] 李克虎，周桂雪，任貴玲.百合品種染色體倍性觀察[J].園藝學(xué)報(bào)，2011(5)：970-976.

[2] 周桂雪，李克虎，張線線.亞洲百合品種倍性、花粉育性及其雜交研究[J].園藝學(xué)報(bào)，2011(4)：733-739.

[3] 徐順超，管潔，曹荷艷.百合雜交育種親和性與染色體倍性相關(guān)性研究[J].分子植物育種，2014(2)：316-322.

[4] 周桂雪.亞洲百合品種倍性調(diào)查與倍性間雜交分析[D].杭州：浙江大學(xué)，2011.

[5] 向仕華，鄭思鄉(xiāng)，趙雁.不同倍性東方百合雜交后代染色體數(shù)目觀察[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007(5)：631-634.

[6] 李靖，李成斌，頓文濤.流式細(xì)胞術(shù)(FCM)在生物學(xué)研究中的應(yīng)用[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008(6)：107-111.

[7] 耿波，孫效文.流式細(xì)胞術(shù)在水生生物DNA含量和倍性分析中的應(yīng)用[J].水產(chǎn)學(xué)雜志，2008(2)：21-24.

[8] 柳青慕，王赟文，王小山.流式細(xì)胞儀快速檢測(cè)鴨茅與多花黑麥草染色體倍性的研究[J].草業(yè)科學(xué)，2012(3)：403-410.

[9] 施春暉，徐蘭蘭，王曉慶.流式細(xì)胞儀鑒定獼猴桃倍性技術(shù)研究[J].植物研究，2014(6)：845-849.

[10] 杜鳳.芒屬植物的染色體倍性及核型研究[D].長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[11] 黃少玲.春石斛蘭品種的倍性鑒定及RAPD分子遺傳圖譜的構(gòu)建[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[12] 王麗花，楊秀梅，吳學(xué)尉.非洲菊大孢子再生植株倍性的快速鑒定方法[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013(1)：155-161.

[13] 于紅梅，王靜，趙密珍，等． 利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)草莓倍性方法的優(yōu)化[J]． 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，43(10)：1530-1533．

[14] LOUREIRO J，RODRIGUEZ E，DOLEZEL J，et al.Two new nuclear isolation buffers for plant DNA flow cytometry：A test with 37 species[J].Ann Bot，2007，100(4)：875-888.

Study on Determination of Lilium Pollen Ploidy by Flow Cytometry

WU Qing-qing1, HU Xiao-jing2, HUANG Wei1*et al

(1.Horticulture Research Institute of Guizhou, Guiyang, Guizhou 550006; 2. College of Horticulture，Guizhou University, Guiyang, Guizhou 550006)

[Objective]For the use of lihium unreduced pollen to sexual polyploidization breeding.[Method] We made use of flow cytometry to determine lilium pollen ploidy by taking the pollen of Marlon and Viviana as materials and leaves for comparison. [Result] By comparing the effect difference of two different cell nuclear extracts, the extract of CyStain UV Precise T was significantly better than that of WPB. Marlon and Viviana leaves measurement results showed that they were diploids and the pollen measurement image showed the two varieties could produce 2npollen on their own. [Conclusion] Flow cytometry can be used to quickly measure lilium pollen ploidy.

Flow cytometry; Lily; Pollen; Ploidy

國(guó)家自然科學(xué)

(31160176)；貴州省科技廳項(xiàng)目(黔科合J字[2010]2090號(hào)；黔科合NY字[2011]3074號(hào)；黔科合成轉(zhuǎn)字[2014]5027號(hào)；黔科合NY字[2015]3012-1號(hào))；貴州省農(nóng)科院院專項(xiàng)(黔農(nóng)科院院專項(xiàng)[2008]032號(hào))。

吳青青(1982- )，男，山東平度人，助理研究員，碩士，從事百合育種與種球繁育方面的研究。*通訊作者，助理研究員，碩士，從事植物遺傳育種方面的研究。

2015-08-22

S 603

A

0517-6611(2015)28-004-03