宮小明， 楊麗君， 王洪濤， 馬榮檜， 丁葵英， 郭禮強(qiáng)， 孫 軍

(1.濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東濰坊 261041;2.威海出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東威海 264200)

液相色譜-高分辨質(zhì)譜測(cè)定動(dòng)物源性食品中均三嗪類藥物殘留

宮小明1， 楊麗君2， 王洪濤1， 馬榮檜1， 丁葵英1， 郭禮強(qiáng)1， 孫 軍1

(1.濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東濰坊 261041;2.威海出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東威海 264200)

[目的]建立動(dòng)物源性食品中均三嗪類藥物及其代謝物殘留的液相色譜-高分辨質(zhì)譜分析方法。[方法] 采用QuEChERS技術(shù)進(jìn)行樣品前處理，利用Exactive液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，建立了動(dòng)物源性食品中地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利砜、妥曲珠利亞砜等4種均三嗪類藥物及其代謝物殘留的分析方法。[結(jié)果] 地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利砜、妥曲珠利亞砜4種均三嗪類藥物在2.0～50.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2>0.99)。牛粉基質(zhì)中4種化合物在5、10和20 μg/kg加標(biāo)水平的回收率為74.5%～90.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為 15.4%～17.5%。[結(jié)論] 該方法穩(wěn)定、可靠，可用于動(dòng)物源性食品中均三嗪藥類物殘留的檢測(cè)。

動(dòng)物源性食品；均三嗪類藥物；QuEChERS；液相色譜-高分辨質(zhì)譜

20世紀(jì)80年代出現(xiàn)的均三嗪類抗球蟲藥因其高效、廣譜、毒性低，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中受到了廣泛重視。目前，生產(chǎn)中使用的均三嗪類藥物主要有地克珠利和妥曲珠利，地克珠利和妥曲珠利可以有效殺滅包括球蟲在內(nèi)的多種原蟲，屬于高效抗球蟲藥物，妥曲珠利在動(dòng)物體內(nèi)主要代謝產(chǎn)物為妥曲珠利砜和妥曲珠利亞砜。

均三嗪類藥物的檢測(cè)主要有氣相色譜-電子捕獲法、液相色譜-紫外檢測(cè)法[1-3]。近年來(lái)，均三嗪類藥物殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法國(guó)內(nèi)外有較多的研究報(bào)道[4-7]，由于分子結(jié)構(gòu)的原因，妥曲珠利和妥曲珠利砜無(wú)論在何種碰撞能量下都無(wú)法得到合適的子離子，因此只能選擇其母離子，利用SIM方式對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)歐盟2003/181/EC 法規(guī)，低分辨質(zhì)譜母離子只能算1分，遠(yuǎn)低于確證4分的要求[8-9]，因此低分辨質(zhì)譜只用于進(jìn)行篩查，在遇到陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，必須進(jìn)行進(jìn)一步確證。軌道阱高分辨質(zhì)譜儀具有較高的分辨率、掃描速度和靈敏度，可以有效去除基質(zhì)干擾，實(shí)現(xiàn)高通量的目標(biāo)物或非目標(biāo)物篩選和高可靠性的確證定量分析[10-12]。筆者采用QuEChERS[13-15]技術(shù)進(jìn)行樣品前處理，利用Exactive液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，建立了動(dòng)物源性食品中地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利砜、妥曲珠利亞砜等4種均三嗪類藥物及其代謝物殘留的分析方法。通過(guò)與低分辨質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果的比較，有效避免了假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

1.1.1儀器。靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(Thermofisher Exactive)；萬(wàn)分之一天平(Mettler AE163)；均質(zhì)器(IKA T25)；振蕩器(IKA MS1)；離心機(jī)(Eppendorf 5810)；氮吹儀(N-EVAP-111)。

1.1.2試劑與材料。地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利砜、妥曲珠利亞砜標(biāo)準(zhǔn)品，其化合結(jié)構(gòu)式見圖1，均購(gòu)自于Sigma-Aldrich公司；乙睛、甲醇、甲酸(色譜純)，水為Milli-Q超純水，使用前過(guò)0.45 μm濾膜；氯化鈉、中性氧化鋁(分析純)；N-丙基乙二胺粉(PSA)、二甲基十八碳硅烷粉(ODS)，均購(gòu)自于Agela Technologies公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取10 mg地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利砜、妥曲珠利亞砜，用乙腈溶解，準(zhǔn)確定容至100 ml，得到濃度為100 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，避光于4 ℃下保存。使用時(shí)用基質(zhì)空白提取液稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。為避免分析物分解，應(yīng)當(dāng)用棕色器皿保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品處理準(zhǔn)確稱取5.0 g樣品，置于100 ml塑料離心管中，加入5.0 g無(wú)水硫酸鎂，加入乙腈15 ml，在均質(zhì)機(jī)上高速均質(zhì)2 min左右，10 000 r/min高速離心10 min，取上清9 ml氮吹濃縮，乙腈定容到1.5 ml，加入150 mg ODS吸附劑玻璃試管中，1 400 r/min渦混2 min，離心后取1 ml上清液，氮吹，1 ml初始流動(dòng)相定容，上機(jī)檢測(cè)。

1.4 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

1.4.1液相色譜條件。色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(3.0 mm ×100 mm，1.8 μm)；柱溫為35 ℃；流速為0.3 ml/min，進(jìn)樣量為10 μl；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水，B為甲醇；梯度洗脫程序：0～2.0 min(10% B)，2.5～6.0 min(10%B～90%B)，6.0～9.0 min(90%B)，10.0～12.0 min(10%B)平衡3 min。

注：A.地克珠利；B.妥曲珠利；C.妥曲珠利亞砜；D.妥曲珠利砜。圖1 4種化合物的分子結(jié)構(gòu)

表1 4種化合物的質(zhì)譜參數(shù)

1.4.2質(zhì)譜條件。全掃描正/負(fù)離子模式，掃描質(zhì)量范圍m/z200～1 000；分辨率為25 000；掃描速度為4 Hz；自動(dòng)增益控制(AGC)目標(biāo)值為10 e6；噴霧電壓為3 500 V；離子傳輸管溫度為320 ℃；鞘氣氣壓為35 Au；輔助氣壓為10 Au；離子源溫度為300 ℃。4種化合物的質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的選擇均三嗪類藥物屬于弱極性物質(zhì)，易溶于甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑，微溶于正己烷和石油醚，在水中的溶解度極低。筆者分別考察了甲醇、乙酸乙酯、乙腈作為提取溶劑，均可以得到良好的提取效果，乙腈能更有效地沉淀蛋白，減少雜質(zhì)干擾，同時(shí)乙腈也有利于下一步使用QuEChERS技術(shù)進(jìn)行凈化，因此選擇乙腈作為提取溶劑。

2.2 各種吸附劑粉對(duì)回收率的影響QuEChERS技術(shù)是2003年由美國(guó)化學(xué)家Steven J.Lehotay和德國(guó)的Michelangelo Anastassiadas[13-14]提出的一種快速、簡(jiǎn)單、低成本的樣品處理方法。該方法采用分散固相萃取(Dispersive-SPE)凈化法，即提取液直接加入吸附劑粉進(jìn)行凈化，經(jīng)離心后上清液上機(jī)檢測(cè)。

為了選擇合適的吸附劑，首先考察各種吸附劑粉對(duì)回收率的影響，取2 ml乙腈溶解的濃度為0.05 μg/ml的4種藥物的混標(biāo)溶液，分別加入150 mg不同的吸附劑，經(jīng)振蕩、離心后，取上清液1 ml，上機(jī)，試驗(yàn)重復(fù)6次，計(jì)算平均回收率。從表2可以看出，ODS對(duì)目標(biāo)物的吸附較少，同時(shí)又可以很好地吸附脂肪酸、維生素、色素、甾醇等雜質(zhì)，因此選擇ODS作為最終的吸附劑。

表2 不同吸附劑對(duì)目標(biāo)化合物回收率的影響

2.3 牛粉樣品高分辨質(zhì)譜與低分辨質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果的比較由于分子結(jié)構(gòu)的原因，妥曲珠利和妥曲珠利砜無(wú)論在何種碰撞能量下都無(wú)法得到合適的子離子，因此只能利用選擇離子掃描(SIM)模式對(duì)母離子進(jìn)行檢測(cè)，QuEChERS技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、快速，缺點(diǎn)是凈化效果差，此前利用低分辨三重四級(jí)桿質(zhì)譜在(SIM)模式對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，可以滿足篩查的要求，但是在遇到復(fù)雜基質(zhì)干擾的情況下，就必須進(jìn)行進(jìn)一步確證。軌道阱高分辨質(zhì)譜儀具有較高的分辨率和靈敏度，可以有效去除基質(zhì)干擾。從圖2可以看出，在妥曲珠利4.3 min左右的出峰時(shí)間，牛粉樣品有一個(gè)明顯的峰；從圖3可以看出，在5.79 min左右妥曲珠利的出峰時(shí)間，牛粉樣品既提取不到妥曲珠利的精確質(zhì)量數(shù)也得不到對(duì)應(yīng)的色譜峰，因此可以判斷牛粉為陰性樣品，低分辨質(zhì)譜下樣品的峰應(yīng)該為雜質(zhì)干擾，為假陽(yáng)性結(jié)果。

注：A.牛粉樣品；B.各類藥物標(biāo)準(zhǔn)品；C.牛粉加標(biāo)樣品。圖2 牛粉樣品、各類藥物標(biāo)準(zhǔn)品和牛粉加標(biāo)樣品的低分辨色譜圖

注：A.牛粉樣品；B.各類藥物標(biāo)準(zhǔn)品；C.牛粉加標(biāo)樣品。圖3 牛粉樣品、各類藥物標(biāo)準(zhǔn)品和牛粉加標(biāo)樣品高分辨色譜圖和在5.79 min的高分辨質(zhì)譜圖

2.4 線性范圍、定量限、回收率和精密度用基質(zhì)提取液配制一系列不同濃度的4種藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次進(jìn)樣，以峰面積為縱軸，以濃度為橫軸，繪制校準(zhǔn)曲線，由工作站可直接計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。由表3可知，4種分析物在2.0～50.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以20 μg/kg空白牛粉添加色譜圖，根據(jù)10倍信噪比計(jì)算定量限，4種化合物的定量限均為2 μg/kg，能滿足日本、歐盟等國(guó)家規(guī)定的最大殘留限量。

用空白樣品加標(biāo)方法進(jìn)行回收率和精密度試驗(yàn)。分別對(duì)牛粉進(jìn)行3個(gè)不同水平的加標(biāo)，每個(gè)水平平行測(cè)定7次，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表3可知，4種化合物在2、10、20 μg/kg加標(biāo)水平的回收率為74.5%～90.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為15.4%～17.5%。

表3 4種藥物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 小結(jié)

筆者將最先應(yīng)用于農(nóng)藥多殘留分析的QuEChERS技術(shù)引入地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利砜、妥曲珠利亞砜等4種均三嗪類藥及其代謝物殘留分析的樣品前處理過(guò)程，針對(duì)妥曲珠利、妥曲珠利砜無(wú)法得到碎片離子，只能采用SIM模式檢測(cè)母離子的特點(diǎn)，借助靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀分辨率、出色的質(zhì)量精度、高靈敏度和寬動(dòng)態(tài)范圍的特點(diǎn)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，與高效液相色譜法-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法相比可以更好地去除基質(zhì)干擾，靈敏度大大提高。該方法具有適用性強(qiáng)、簡(jiǎn)單快速、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均能滿足日常檢測(cè)分析的要求，應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)，取得了滿意的效果。

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Determination of Diclazuril, Toltrazuril and Metabolite Residues in Animal-derived Food by Liquid Chromatography—High Resolution Mass Spectrometry

GONG Xiao-ming1， YANG Li-jun2, WANG Hong-tao1et al

(1.Weifang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Weifang, Shandong 261041;2.Weihai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Weihai,Shandong 264200)

[Objective] The research aimed to establish the detecting method of liquid chromatography—high-resolution mass spectrometry for detecting the residues of diclazuril，toltrazuril and its metabolites in animal-derived food. [Method] The samples were pre-treated by using QuEChERS technology and detect by using Exactive liquid chromatography—high resolution mass spectrometry. The detecting method of liquid chromatography—high-resolution mass spectrometry for detecting the residues of diclazuril，toltrazuril and its metabolites in animal-derived food was established. [Result] Diclazuril，toltrazuril and its metabolites showed a good linear correlation in the range of 2.0-50.0 μg/L(r2>0.99). The average recoveries of these four compounds in beef power at the spiked levels of 2，10，20 μg/kg was 74.5%-90.1%, and the relative standard deviations(RSD)was 15.4%-17.5%. [Conclusion] This method was stable and reliable, and so it could be used for detecting diclazuril, toltrazuril and its metabolites.

Animal-derived food; 1,3,5-triazine; QuEChERS; Liquid chromatography—high-resolution mass spectrometry

國(guó)家質(zhì)檢總局科研項(xiàng)目(201310143)。

宮小明(1976- )，男，山東萊西人，高級(jí)工程師，碩士，從事獸藥殘留、真菌毒素及添加劑研究。

2015-08-13

S 851.347

A

0517-6611(2015)28-114-04