張 苗， 劉 文， 陳荊曉， 陳敬華

（江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

還原響應(yīng)型K5多糖膠束藥物載體的研究

張 苗， 劉 文， 陳荊曉， 陳敬華*

（江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

為了解決傳統(tǒng)抗腫瘤藥物阿霉素水溶性不佳，對(duì)機(jī)體選擇性差的情況，設(shè)計(jì)了一種還原敏感的K5膠束藥物載體。將脫氧膽酸（DOCA）通過(guò)雙硫鍵與K5多糖連接，制備兩親性K5PSSS-DOCA（KSD）綴合物。該綴合物在水溶液中可自組裝形成膠束并包載模型藥物阿霉素（DOX）。膠束形貌通過(guò)透射電鏡進(jìn)行觀(guān)測(cè)，并進(jìn)一步通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定其水合粒徑及ζ-電位。膠束為球形，其水合粒徑和ζ電位在載藥前分別為225 nm與-31 mV，載藥后為241 nm與-31 mV，具有較好的穩(wěn)定性。該膠束在谷胱甘肽（GSH）存在條件下，可表現(xiàn)出明顯的還原響應(yīng)藥物釋放行為。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，載體材料有良好的生物相容性，含藥膠束對(duì)腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）低于正常細(xì)胞，對(duì)腫瘤細(xì)胞有明顯選擇性。

K5多糖；膠束；還原響應(yīng)；藥物傳遞；阿霉素

聚合物膠束作為常用的藥物載體，可包載藥物并提高藥物的水溶性、穩(wěn)定性，改善藥物的體內(nèi)分布和靶向性[1-2]，引起了廣泛的關(guān)注。通常，制備膠束的材料多為合成型高分子。這些材料在體內(nèi)難以降解，長(zhǎng)期使用會(huì)引起腎臟毒性[3]。同時(shí)，合成材料還會(huì)因免疫原性而在體內(nèi)被清除，降低了藥物的利用度。近年來(lái)，天然來(lái)源的多糖類(lèi)物質(zhì)因其良好的生物相容性、生物可降解性等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于藥物載體的研究[4-6]。

K5多糖是動(dòng)物體內(nèi)肝素和硫酸乙酰肝素的生物合成前體[7]，可從大腸桿菌K5菌株的莢膜中分離得到[8]。K5多糖未經(jīng)硫酸化，可避免產(chǎn)生肝素使用中出現(xiàn)的諸多副作用，如出血、血小板減少癥。由于K5多糖帶有負(fù)電荷，在血液中不會(huì)非特異性吸附血漿蛋白而沉淀[9]。除不具有免疫原性外，K5多糖還具有良好的進(jìn)胞能力[10]。基于這些特點(diǎn)，K5多糖可用于提高藥物在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，其作為藥物傳遞系統(tǒng)具有較大的潛力。

作者以發(fā)酵制備得到的K5多糖為原料，通過(guò)雙硫鍵連接脫氧膽酸構(gòu)建兩親性綴合物，用于抗腫瘤藥物阿霉素的包載和傳遞。利用腫瘤細(xì)胞內(nèi)部還原型谷胱甘肽（GSH）過(guò)量表達(dá)的特性[11-12]，實(shí)現(xiàn)載體在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的崩解及藥物的快速釋放。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與細(xì)胞K5菌株：購(gòu)自ATCC；COS7與HeLa細(xì)胞：購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院保藏中心（上海）。

1.1.2 試劑脫氧膽酸、丙酮、乙酸乙酯、三乙胺（TEA）、二甲基甲酰胺（DMF）、甲酰胺：購(gòu)自國(guó)藥上海試劑公司；反應(yīng)用的溶劑使用前均重蒸純化；N，N-二異丙基碳二亞胺 （DIC）、N-羥基丁二酰亞胺（NHS）：購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司；胱胺·鹽酸鹽：購(gòu)自百靈威；阿霉素·鹽酸鹽（DOX·HCl）：購(gòu)自浙江海正制藥有限公司。

1.1.3 儀器核磁共振波譜儀：德國(guó)Bruker公司產(chǎn)品；JEM-2100透射電鏡：日本JEOL公司產(chǎn)品；Micromass platform LCZ質(zhì)譜儀：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；Zetasizer Nano ZS納米粒度儀：英國(guó)Malvern公司產(chǎn)品；MULTISKAN GO酶標(biāo)儀：美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品。

1.2 KSD的合成

1.2.1 胱胺修飾的脫氧膽酸（DOCA-CYS）的合成將5 g DOCA溶于10 mL DMF，在冰浴狀態(tài)下加入1.96 mL DIC與1.46 g NHS之后，稱(chēng)取4.2 g胱胺鹽酸鹽溶于10 mL甲酰胺，并加入2 mL三乙胺，再將溶液滴加入DOCA溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下于25℃攪拌反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后用水沉淀，并反復(fù)洗滌，真空干燥。粗產(chǎn)物溶于乙酸乙酯，將溶解部分充分干燥，獲得DOCA-CYS。

1.2.2 KSD的合成根據(jù)文獻(xiàn)所述[13-14]，經(jīng)發(fā)酵、醇沉與離子交換等方法純化獲得了K5多糖。

將100 mg K5多糖溶于10 mL甲酰胺，之后置于冰浴中，并加入0.3 mL DIC與0.22 g NHS，攪拌15 min后，加入 10 mL含有1 g DOCA-CYS的DMF溶液，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，于25℃攪拌反應(yīng)36 h[15]。反應(yīng)結(jié)束后，將濃縮溶液用冰丙酮沉淀3次，除去未反應(yīng)的DOCA-CYS。之后將沉淀溶于蒸餾水，用截留相對(duì)分子質(zhì)量（MWCO）3 500的透析袋對(duì)水透析提純，凍干收集產(chǎn)品。

1.3 載藥KSD膠束的制備與形態(tài)表征

稱(chēng)取5 mg阿霉素鹽酸鹽溶于1 mL DMF，并加入1 mL TEA，避光攪拌過(guò)夜脫去鹽酸鹽。之后將其加入到5 mL含有20 mg KSD的甲酰胺溶液中，于25℃避光攪拌過(guò)夜。之后將液體裝入透析袋（MWCO= 3 500）避光對(duì)水透析24 h，得載藥KSD膠束，并將其用于藥物釋放實(shí)驗(yàn)，另取樣凍干，測(cè)定載藥量。

1.4 載藥率與包封率測(cè)定

稱(chēng)取一定量?jī)龈傻妮d藥膠束，溶于v（DMF）∶v（甲酰胺）=1∶1溶液中，配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，測(cè)定其在480 nm下的吸光值，并計(jì)算載藥量與包封率。其中，載藥量（%）=膠束中包載的阿霉素的量/載藥膠束的總質(zhì)量×100；包封率（%）=膠束中包載的阿霉素的量/阿霉素投入量×100

1.5 體外釋放行為的研究

載藥KSD膠束的體外藥物釋放分別在PBS（pH=7.4）及含有10 mmol/L GSH的PBS（pH=7.4）中進(jìn)行，取1 mL步驟1.3中所制備的載藥膠束溶液裝入透析袋（相對(duì)分子質(zhì)量為3 500）中并浸沒(méi)于10 mL上述PBS中，在37℃，100 r/min搖床震蕩下進(jìn)行藥物釋放實(shí)驗(yàn)，每隔一段時(shí)間取樣并更換PBS，測(cè)定阿霉素累積釋放量。

1.6 載藥KSD膠束細(xì)胞毒性研究

將HeLa與COS7細(xì)胞以8 000個(gè)/孔的密度接種于96孔板，培養(yǎng)過(guò)夜后將培養(yǎng)基換成100 μL含KSD膠束的培養(yǎng)基溶液，共培養(yǎng)48 h后用MTT法測(cè)定每孔細(xì)胞存活率。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)4組，取平均值。

載藥膠束的細(xì)胞毒性采用同樣的方法測(cè)定，以等當(dāng)量的阿霉素為陽(yáng)性對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)4組，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 KSD的合成

經(jīng)多步純化獲得的K5多糖相對(duì)分子質(zhì)量約為50 000[13]。

通過(guò)控制投料量及滴加速度，制備單取代胱胺化DOCA（DOCA-CYS），其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。目標(biāo)產(chǎn)物經(jīng)沉淀與乙酸乙酯溶解分離后，通過(guò)質(zhì)譜對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行鑒定。如圖2所示，譜圖中527.1處的峰是產(chǎn)品的分子離子峰 （M+H），與理論相對(duì)分子質(zhì)量（526.3）相吻合，這說(shuō)明DOCA-CYS成功得以制備。

之后，利用胱胺上的氨基與K5多糖葡萄糖醛酸結(jié)構(gòu)中的羧基進(jìn)行反應(yīng)，制備目標(biāo)產(chǎn)物KSD，產(chǎn)品經(jīng)1H NMR譜圖鑒定。如圖3所示，與K5多糖（圖3（a））相比，0.97~1.76處出現(xiàn)了DOCA甾環(huán)亞甲基氫的峰（圖3b）。由于未反應(yīng)的DOCA-CYS經(jīng)丙酮除去，這表明DOCA-CYS已經(jīng)被連接到了K5多糖分子上。利用0.62處DOCA甾環(huán)上18位-CH3中氫原子與5.31處K5多糖氨基葡萄糖1位-CH中氫原子的峰面積比計(jì)算DOCA的取代度。結(jié)果表明，平均每10個(gè)K5多糖單元上接枝了1個(gè)DOCA分子。

2.2 載藥KSD膠束的制備與形態(tài)表征

KSD膠束載藥前后的粒徑大小通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖4與表1所示。在水溶液中，KSD的平均粒徑為225 nm（PDI=0.254），而載藥后，膠束的尺寸有所增加，為241 nm（PDI=0.248）。這主要是因?yàn)槭杷缘哪Ｐ退幬锇⒚顾乇话谀z束內(nèi)部，導(dǎo)致膠束粒徑增大。膠束載藥前后均可保持良好的尺寸穩(wěn)定性。通過(guò)透射電子顯微鏡觀(guān)測(cè)干態(tài)下膠束的形貌，結(jié)果如圖5所示。膠束在載藥前后均為球形，其平均尺寸分別為45 nm與90 nm。由于電鏡觀(guān)測(cè)為干態(tài)下膠束，因而小于DLS測(cè)定的水合直徑。未載藥的膠束尺寸變化較大，而載藥膠束變化較小，這主要是由于載藥膠束內(nèi)部部分空間被阿霉素占據(jù)，具有更為緊密的結(jié)構(gòu)，因而體積收縮較小。另外，測(cè)定結(jié)果還顯示載藥前后，膠束的ζ-電位都約為為-31 mV，理論上說(shuō)明膠束具有良好的穩(wěn)定性。由于K5多糖葡萄糖醛酸上帶有羧基，這一結(jié)果也表明膠束外層親水殼由帶負(fù)電的K5多糖構(gòu)成。膠束表面帶有負(fù)電荷，可有效避免血漿蛋白在膠束表面的吸附，可提高膠束在血液中的循環(huán)能力。

圖1 DOCA-CYS和KSD綴合物的合成路線(xiàn)圖Fig.1 Synthesis routes of DOCA-CYS and KSD conjugate

圖2 DOCA-CYS的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrum of DOCA-CYS

圖3 K5多糖在D2O（a）中與KSD綴合物在CD3OD/D2O中（b）的核磁1H圖譜Fig.31H NMR spectra of（a）K5 polysaccharide in D2O，（b）KSD in CD3OD/D2O

2.3 載藥與體外釋放行為的研究

載藥KSD膠束的載藥量（DL）與包封率（EE）分別為11.54%與46.17%如表1所示，這一結(jié)果表明載體有較好的載藥能力，DOX可分別通過(guò)疏水作用和電荷吸附作用被包載在KSD膠束疏水性?xún)?nèi)核以及帶負(fù)電的外殼上。

圖4 KSD膠束（a）與載DOX KSD膠束（b）的粒徑分布圖Fig.4 Size distributions of KSD micelles（a）and DOX-loaded KSD micelles（b）

圖5 KSD膠束（a）與載DOX KSD膠束（b）的透射電鏡圖像（標(biāo)尺為100 nm）Fig.5 TEM images of KSD micelles（a）and DOX-loaded KSD micelles（b），scale bar：100 nm

表1 KSD膠束和載藥KSD膠束的表征Table 1 Characterization of KSD micelles and DOX-loaded KSD micelles

體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)分別在PBS（pH 7.4）和含有GSH（10 mmol/L）的PBS（pH 7.4）中進(jìn)行。PBS用于模擬體內(nèi)血液循環(huán)pH環(huán)境，而含有GSH的PBS則用于模擬腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的環(huán)境，結(jié)果如圖6所示。在含有10 mmol/L GSH溶液中，阿霉素100 h內(nèi)的累積釋放率可達(dá)到90%。無(wú)GSH存在時(shí)，阿霉素的累積釋放率僅為50%。這一差別主要是由于GSH可斷開(kāi)KSD膠束中用于連接親水性K5多糖和疏水性DOCA的雙硫鍵，導(dǎo)致膠束解離，因此阿霉素可以快速釋放。由于腫瘤細(xì)胞中GSH含量較高，載藥膠束可以實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞定點(diǎn)的快速藥物釋放。

圖6 載藥KSD膠束在不同介質(zhì)中的釋藥曲線(xiàn)圖。（a）pH 7.4 PBS；（b）pH 7.4 PBS含10 mmol/L GSHFig.6 Drug release profiles of DOX-loaded KSD micelles at different release media

2.4 KSD載藥體系細(xì)胞毒性研究

2.4.1 KSD載體毒性測(cè)定分別采用腫瘤細(xì)胞HeLa與正常細(xì)胞COS7來(lái)評(píng)價(jià)KSD的細(xì)胞毒性，如圖7所示，材料對(duì)兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)均未表現(xiàn)出明顯的抑制作用。當(dāng)KSD的質(zhì)量濃度達(dá)到300 mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率依然大于80%，顯示該材料生物相容性良好。

2.4.2 含藥載體細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)載藥KSD膠束的細(xì)胞毒性如圖8，圖9所示。結(jié)果表明，對(duì)于HeLa細(xì)胞，載藥KSD膠束與DOX對(duì)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）結(jié)果分別為0.89 mg/L及0.50 mg/L，這說(shuō)明KSD并未影響DOX對(duì)于細(xì)胞的抑制作用。由于HeLa細(xì)胞內(nèi)GSH過(guò)量表達(dá)，載藥KSD膠束可以有效釋放出DOX，并抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。而對(duì)于COS7細(xì)胞，載藥KSD膠束與DOX對(duì)細(xì)胞的IC50值則分別為4.60 mg/L與0.29 mg/L。與DOX相比，載藥膠束對(duì)COS7的IC50約提高了15倍，這表明載藥膠束對(duì)正常細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用較小，對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有較好的選擇抑制效果。在COS7細(xì)胞中，GSH并未過(guò)量表達(dá)，DOX的釋放率偏低，因而表現(xiàn)出兩種細(xì)胞中不同的IC50值。

圖7 KSD載體對(duì)HeLa與COS7的細(xì)胞毒性Fig.7 In vitro cytotoxicity of KSD against HeLa and COS7 cells

圖8 DOX與載藥KSD膠束對(duì)Hela細(xì)胞的毒性Fig.8 In vitro cytotoxicity of DOX and DOX-loaded micelles against HeLa cells

圖9 DOX與載藥KSD膠束對(duì)COS7細(xì)胞的毒性Fig.9 In vitro cytotoxicity of DOX and DOX-loaded micelles against COS7 cells

3 結(jié)語(yǔ)

利用發(fā)酵獲得的K5多糖制備了含雙硫鍵的KSD綴合物，其可在水溶液中自組裝形成形態(tài)大小均一且分散性良好的膠束。KSD膠束可在疏水內(nèi)腔中包裹模型抗癌藥物阿霉素，并且在GSH存在的環(huán)境中表現(xiàn)出了DOX的還原敏感釋放行為；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明KSD膠束有良好的生物相容性，在腫瘤細(xì)胞中，載藥KSD膠束可表現(xiàn)出與阿霉素相似的細(xì)胞抑制效果，而對(duì)正常細(xì)胞表現(xiàn)出降低的抑制作用。這種KSD膠束對(duì)腫瘤細(xì)胞具有一定的藥物釋放選擇性，在臨床應(yīng)用方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

[1]Kataoka K，Harada A，Nagasaki Y.Block copolymer micelles for drug delivery：design，characterization and biological significance [J].Adv Drug Deliver Rev，2001，47（1）：113-131.

[2]Nishiyama N，Kataoka K.Current state，achievements，and future prospects of polymeric micelles as nanocarriers for drug and gene delivery[J].Pharmacol Therapeut，2006，112（3）：630-648.

[3]Richter A W，Akerblom E.Polyethylene glycol reactive antibodies in man：titer distribution in allergic patients treated with monomethoxy polyethylene glycol modified allergens or placebo，and in healthy blood donors[J].Int Arch Allergy Imm，1984，74（1）：36-39.

[4]Baldwin A D，Kiick K L.Polysaccharide-modified synthetic polymeric biomaterials[J].J Pept Sci，2010，94（1）：128-1240.

[5]Mizrahy S，Peer D.Polysaccharides as building blocks for nanotherapeutics[J].Chem Soc Rev，2012，41：2623-2640.

[6]XU Z P，ZENG Q H，LU G，et al.Inorganic nanoparticles as carriers for efficient cellular delivery[J].Chem Eng Sci，2006，61（3）：1027-1240.

[7]趙雷，嚴(yán)子琴，王暢，等.大腸桿菌產(chǎn)肝素前體heparosan的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)進(jìn)展，2011，1（3）：195-200.

ZHAO Lei，YAN Ziqin，WANG Chang，et al.Progress of study of heparoson production by E.coli K5 [J].Current Biotechnology，2011，1（3）：195-200.（in Chinese）

[8]王小元，宋鴻軍.細(xì)菌內(nèi)毒素的生物合成途徑及分子結(jié)構(gòu)多樣性[J].2013，32（10）：1009-1015. WANG Xiaoyuan，SONG Hongjun.Biosynthesis pathway and structure variability of bacterial endotoxin[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2013，32（10）：1009-1015.（in Chinese）

[9]Blundell C D，Roberts I S，Sheehan J K，et al.Investigating the molecular basis for the virulence of Escherichia coli K5 by nuclear magnetic resonance analysis of the capsule polysaccharide[J].J Mol Microb Biotech，2009，17：71-82.

[10]Raman K，Mencio C，Desai U R，et al.Sulfation patterns determine cellular internalization of heparin-like polysaccharides[J]. Mol Pharm，2013，10（4）：1442-1449.

[11]Ottaviano F G，Handy D E，Loscalzo J.Redox regulation in the extracellular environment[J].Circ J，2008，72（1）：1-16.

[12]MENG F H，Hennink W E，ZHONG Z Y.Reduction-sensitive polymers and bioconjugates for biomedical applications[J]. Biomaterials，2009，30（12）：2180-2198.

[13]ZHANG CY，LIU L，CHEN J H，et al.Metabolic engineering of Escherichia coli BL21 for biosynthesis of heparosan，a bioengineered heparin precursor[J].Metab Eng，2012，14（5）：521-527.

[14]Ly M，WANG Z Y，Laremore T N，et al.Analysis of E.coli K5 capsular polysaccharide heparosan[J].Anal Bioanal Chem，2011，399（2）：737-745.

[15]LI J，HUO M R，WANG J，et al.Redox-sensitive micelles self-assembled from amphiphilic hyaluronic acid-deoxycholic acid conjugates for targeted intracellular delivery of paclitaxel[J].Biomaterials，2012，33：2310-2320.

Preparation and Properties of the Redox-Sensitive K5 Polysaccharide Micelles as Drug Carrier

ZHANG Miao， LIU Wen， CHEN Jingxiao， CHEN Jinghua*
（School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

To overcome the poor water solubility or lack of tumor-targeting of Doxorubicin（DOX），we designed and fabricate the redox-sensitive K5 polysaccharide micelles as drug carrier，methods：An amphiphilic K5PS-SS-DOCA （KSD）conjugate was designed and prepared by covalently coupling deoxycholic acid （DOCA）with K5 polysaccharide（K5PS）via disulfide bonds.The conjugate could self-assemble into micelles in aqueous solution and encaspulate model drug DOX. The morphology of the micelles was observed by TEM，and the size and ζ-potential were measured by DLS.Results：The micelles were of spherical shape.The average size and ζ-potential was 225 nm and-31 mV for the micelles，and 241 nm and-31 mV for the DOX-loaded micelles，showing favorable stability.The DOX-loaded micelles could behave redox-sensitive drug release behavior in the solution containing 10 mM GSH.In vitro cytotoxicity showed that the bare micelles were biocompatible and DOX-loaded KSD micelles were more cytotoxic against tumor cells than normalcells.

K5 polysaccharide，micelles，redox sensitive，drug delivery，doxorubicin

R 944.9

A

1673—1689（2015）01—0034—06

2014-04-09

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（51303068）；教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目（20110093110008）；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK2012557）；武漢大學(xué)生物醫(yī)用高分子材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目（20110401）。

*通信作者：陳敬華（1971—），男，湖北黃石人，理學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事生物大分子和生物功能材料研究。

E-mail：jhchenwhut@126.com