高 聰， 張阿磊， 陳可泉， 郝之奎， 童軍茂*

（1.石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800；3.臺(tái)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用生物技術(shù)研究所，浙江 臺(tái)州318000）

Chitinibacter sp.GC72的篩選鑒定及其幾丁質(zhì)降解產(chǎn)物研究

高 聰1， 張阿磊2， 陳可泉2， 郝之奎3， 童軍茂*1

（1.石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800；3.臺(tái)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用生物技術(shù)研究所，浙江 臺(tái)州318000）

為向幾丁質(zhì)酶資源的開(kāi)發(fā)利用提供研究基礎(chǔ)，作者篩選獲得了一株具有高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活性的細(xì)菌。經(jīng)形態(tài)、生理生化及分子生物學(xué)研究手段鑒定表明該菌屬奈瑟菌科，Chitinibacter屬，命名為Chitinibacter sp.GC72。經(jīng)1 L發(fā)酵體系檢測(cè)，其粗酶液酶活可達(dá)2 835 U/g。利用薄層層析法、液相色譜法和質(zhì)譜法對(duì)其酶解幾丁質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行了分析鑒定，結(jié)果表明產(chǎn)物主要為N-乙酰-D-氨基葡萄糖。最后利用該酶進(jìn)行了多次酶解實(shí)驗(yàn)，證實(shí)投入3.44 U酶量經(jīng)27 h轉(zhuǎn)化可降解200 mg幾丁質(zhì)至159 mg N-乙酰-D-氨基葡萄糖，收率為79.6%。

Chitinibacter sp.GC72；菌種鑒定；幾丁質(zhì)酶；降解產(chǎn)物；N-乙酰-D-氨基葡萄糖

幾丁質(zhì)，又名甲殼素，主要存在于甲殼綱動(dòng)物 外殼、昆蟲(chóng)外殼、真菌細(xì)胞壁中[1]，是自然界中含量?jī)H次于纖維素的第二大天然高分子化合物，由單體N-乙酰-D-氨基葡萄糖（GlcNAc）通過(guò)β-1，4-糖苷鍵連接而成[2-3]。幾丁質(zhì)經(jīng)降解后可以生成多種產(chǎn)物，主要包括殼聚糖、幾丁寡糖、GlcNAc、氨基葡萄糖（GlcN）等。這些產(chǎn)物目前在食品[4]、醫(yī)藥[5]、農(nóng)業(yè)[6]等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。截至2011年，作為營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑的氨基葡萄糖及其衍生物產(chǎn)品的全球銷(xiāo)售額已逾20億美元[7]，預(yù)計(jì)到2017年，全球氨基葡萄糖產(chǎn)量可達(dá)46 600 t[8]。

據(jù)中國(guó)醫(yī)藥信息網(wǎng)報(bào)道，我國(guó)85%的商用氨基葡萄糖產(chǎn)品是通過(guò)化學(xué)法降解海洋甲殼動(dòng)物外殼制備的。但是化學(xué)法存在生產(chǎn)成本高、得率低、環(huán)境不友好等亟需改進(jìn)的問(wèn)題[9]。目前研究的熱點(diǎn)是生物酶法降解幾丁質(zhì)，它具有生產(chǎn)條件溫和、環(huán)境友好、產(chǎn)物活性高的優(yōu)點(diǎn)，有望替代化學(xué)法生產(chǎn)氨基葡萄糖產(chǎn)品。但是目前的研究也存在酶解效率不高、降解產(chǎn)物不純的瓶頸，如Aeromonas hydrophila H2330所產(chǎn)的粗酶降解幾丁質(zhì) 10 d所獲得的GlcNAc收率為77%，Bacillus licheniformis SK-1分泌的粗酶降解幾丁質(zhì)獲得的GlcNAc收率僅為41%，而且產(chǎn)物混雜幾丁二糖[10-11]。篩選到一株酶解效率高、降解產(chǎn)物純度高的菌株將會(huì)在未來(lái)幾丁質(zhì)高值化利用方面擁有巨大的前景。

作者對(duì)篩選獲得的菌株進(jìn)行了形態(tài)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)及基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，對(duì)菌株進(jìn)行了分類(lèi)鑒定。最后利用薄層層析法、色譜法和質(zhì)譜法對(duì)該菌所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)的產(chǎn)物進(jìn)行了定性及定量研究，為今后對(duì)其幾丁質(zhì)酶的開(kāi)發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 菌種

菌種來(lái)源于南京浦口區(qū)一廢棄池塘 （32°08′N(xiāo)，118°64′E），現(xiàn)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（保藏號(hào)：CCTCC M 2014113）。

1.2 試劑及儀器

膠體幾丁質(zhì)按Sun Chul Kang[12]的方法制備；DNS試劑參照國(guó)家輕工業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)方法配置；粉粒幾丁質(zhì)、氨基葡萄糖鹽酸鹽、N-乙酰-D-氨基葡萄糖：Aladdin公司產(chǎn)品；TaKaRa試劑盒：大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；DNA Marker：北京TransGen Biotech公司產(chǎn)品；其他試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)。

Biolog細(xì)菌自動(dòng)鑒定儀：廣州市華粵行儀器有限公司產(chǎn)品；Agilent 1290 UHPLC超高效液相色譜、Agilent Q-TOF G6520 LC/MS液質(zhì)聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品。

1.3 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基（g/L）：粉粒幾丁質(zhì)0.5；硫酸鎂0.5，磷酸二氫鉀0.7，磷酸氫二鉀0.3，瓊脂粉20，pH 7.0～7.2，121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖4；蛋白胨4；酵母膏4；硫酸鎂0.5；磷酸氫二鉀0.7；磷酸氫二鉀0.3；pH 7.0～7.2，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖2；粉粒幾丁質(zhì)3；蛋白胨4；硫酸鎂0.5；磷酸氫二鉀0.7；磷酸氫二鉀0.3；pH 7.2～7.4，121℃滅菌20 min。

1.4 幾丁質(zhì)酶活測(cè)定方法

將1.4 mL 50 mmol/L PB緩沖液（pH 7.0）和0.5 mL 0.5 g/dL的膠體幾丁質(zhì)加100 μL酶液組成的反應(yīng)體系置于37℃水浴30 min，沸水浴5 min中止反應(yīng)，冷卻至室溫后加入2 mL DNS試劑，沸水浴5 min，離心后取上清，在波長(zhǎng)540 nm下測(cè)吸光度，以滅活的等量酶液作空白對(duì)照。

酶活定義為37℃下1 min轉(zhuǎn)化底物膠體幾丁質(zhì)產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量規(guī)定為1個(gè)活力單位U[13]。

1.5 菌株篩選方法

1.5.1 富集培養(yǎng)取50 mL肉湯培養(yǎng)基裝于500 mL三角瓶中，滅菌后接入待篩樣品，37℃、200 r/ min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)24 h，得到富集的菌液。

1.5.2 平板透明圈篩選用無(wú)菌單層濾紙將富集培養(yǎng)液過(guò)濾，梯度稀釋至適當(dāng)濃度，吸取約0.2 mL稀釋液涂布于篩選培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)5 d，觀察、挑取產(chǎn)透明圈菌株。將篩選獲得的菌株點(diǎn)樣于篩選培養(yǎng)基平板上復(fù)篩，37℃培養(yǎng)5 d，以菌體生長(zhǎng)速度和透明圈大小為標(biāo)準(zhǔn)，擇優(yōu)菌株做斜面保藏。

1.5.3 搖瓶復(fù)篩50 mL搖瓶篩選培養(yǎng)基裝于500 mL三角瓶中，每瓶接入1環(huán)復(fù)篩菌株斜面菌種，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，發(fā)酵液離心得粗酶液，測(cè)定酶活力，最終保留產(chǎn)酶活力最高的菌株。

1.6 菌株的鑒定

1.6.1 形態(tài)和培養(yǎng)特征參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)和培養(yǎng)特征觀察。

1.6.2 生理生化特征采用Biolog細(xì)菌自動(dòng)鑒定儀檢測(cè)該菌對(duì)碳源的利用嗜好和對(duì)化學(xué)物質(zhì)的敏感程度。并根據(jù)最終獲得的表型指紋同Biolog數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，以判斷微生物的種屬。

1.6.3 菌株總 DNA的提取及 16S rDNA的擴(kuò)增細(xì)菌總DNA提取方法嚴(yán)格按照TaKaRa試劑盒提供的操作進(jìn)行。PCR的上、下游引物分別為27F，5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R，5'-GGTTA CCTTGTTACGACTT-3'。熱循環(huán)參數(shù)為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物由蘇州GENEWIZ生物科技有限公司測(cè)序。

1.7 粗酶液的制備

對(duì)該菌進(jìn)行了1 L發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)酶結(jié)束后離心獲得上清酶液。采用梯度緩慢流加飽和硫酸銨溶液的方法去除雜蛋白并獲得目標(biāo)蛋白，利用濃度為20 mmol/L的PB緩沖液（pH 7.0）充分透析以去除鹽離子，所有操作均在4℃條件下進(jìn)行。

1.8 酶解產(chǎn)物的制備

以100目篩粉粒幾丁質(zhì)作為轉(zhuǎn)化底物，并加入pH 7.0的PB緩沖液穩(wěn)定體系pH值，經(jīng)121℃，20 min滅菌后冷卻至室溫備用。加入適量的無(wú)菌過(guò)膜（0.22 μm）酶液進(jìn)行攪拌轉(zhuǎn)化，酶解溫度恒定為36± 1℃，轉(zhuǎn)化結(jié)束后離心獲得上清液過(guò)膜（0.22 μm）后置于4℃條件下貯藏。

1.9 酶解產(chǎn)物的鑒定

1.9.1 TLC法TLC法選用v（異丙醇）∶v（水）∶v（氨水）=70∶30∶1作為展層劑，點(diǎn)樣量10 μL。點(diǎn)板結(jié)束后晾干，將苯胺-二苯胺磷酸顯色劑均勻噴霧在薄層板上，并置85℃烘箱內(nèi)加熱至層析斑點(diǎn)顯現(xiàn)。以常見(jiàn)還原性糖標(biāo)樣為參照，通過(guò)層析斑點(diǎn)位置定性確定酶解產(chǎn)物。

1.9.2 液相檢測(cè)條件液相分析在Agilent 1290 Infinity UHPLC上進(jìn)行，色譜柱為Alltima HP HILIC柱（4.6×250 mm），流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)85%乙腈；流速為0.8 mL/min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫40℃。

1.9.3 質(zhì)譜檢測(cè)條件質(zhì)譜分析在Agilent Q-TOF G6520 LC/MS系統(tǒng)上進(jìn)行。使用高純氮?dú)庾鲮F化器和輔助氣，氬氣做碰撞氣，離子源參數(shù)為：ESI毛細(xì)管電壓+4.0 kV；離子源溫度120℃；霧化器溫度350℃；脫溶劑氣流速600 L/h；錐孔氣流速50 L/h。TOF參數(shù)為：Fragmentor：135 V；Skimmer：65 V；OCT 1RF Vpp：750 V。質(zhì)量掃描范圍均為100～1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶細(xì)菌的篩選

從安徽阜陽(yáng)市、江蘇南京市兩地獲得的土壤、腐爛蝦殼共27份樣品中分離出6株具有幾丁質(zhì)降解能力的細(xì)菌。篩選結(jié)果如表1所示，根據(jù)透明圈與菌落的比值及搖瓶復(fù)篩測(cè)定的酶活結(jié)果，選留菌株GC-72作為下一步研究菌株。

表1 菌株篩選結(jié)果Table 1 Results of strain screening

2.2 菌落形態(tài)特征

菌株在篩選培養(yǎng)基37℃下培養(yǎng)72 h后，能形成2~3 mm單菌落。菌落呈圓形（圖1），乳白色，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)，易挑起。光學(xué)顯微鏡觀察該菌為革蘭氏陰性菌，經(jīng)生物顯微鏡測(cè)定該菌大小約為1.9 μm×0.8 μm，呈彎曲梭桿狀。

圖1 平板透明圈和菌體顯微照片F(xiàn)ig.1 Clear zone in colloidal chitin agar （a）and photomicrographs of the strain（b）

2.3 菌株的生理生化特征

該菌嚴(yán)格好氧，適應(yīng)生長(zhǎng)溫度20~37℃，適宜生長(zhǎng)pH值范圍為7~10。GenⅢ微孔板對(duì)該菌進(jìn)行碳源的利用程度試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果如下表2?？梢?jiàn)該菌對(duì)N-乙酰-D-氨基葡萄糖、葡糖醛酰胺、果糖利用好，對(duì)糊精、葡萄糖、葡糖酸、葡糖醛酸、D-果糖-6-磷酸等碳源利用較佳，對(duì)其余的碳源利用不佳?；瘜W(xué)物質(zhì)敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明該菌微弱耐受利福霉素SV，對(duì)高鹽環(huán)境和低pH值、絲氨酸等不耐受。

表2 碳源利用試驗(yàn)（24 h）Table 2 Utilization of carbon sources（24 h）

根據(jù)該菌對(duì)碳源的利用嗜好性和對(duì)化學(xué)物質(zhì)的敏感程度結(jié)果，Biolog細(xì)菌自動(dòng)鑒定儀的鑒定結(jié)果為Pedobacter heperinus菌，SIM值為0.251，經(jīng)查閱資料該菌為厭氧菌，與供試菌不符，可信度較低?？赡艿脑蚴窃摼壳安辉趯?shí)驗(yàn)室Biolog細(xì)菌自動(dòng)鑒定儀數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)。因此有必要采用分子生物學(xué)研究手段繼續(xù)對(duì)該菌進(jìn)行研究。

2.4 16S rDNA的擴(kuò)增及序列分析

采用TAE電泳緩沖液，泳道1、2內(nèi)加入5 μL PCR產(chǎn)物，泳道 M內(nèi)加入 Trans 2KPlus DNA Marker，在0.8 g/dL瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。電壓穩(wěn)定在100 V，電泳時(shí)間約40 min。電泳結(jié)束后在紫外燈下觀察，結(jié)果如下圖2所示，可見(jiàn)在1 500 bp位置處泳道1、2內(nèi)有一明顯的條帶。

圖2 16S rDNA PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose electrophoresis of 16S rDNA PCR product

2.5 構(gòu)建同源樹(shù)

將該菌的16S rDNA測(cè)序結(jié)果與GeneBank中的序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)該菌與其同源性最高的模式菌株均屬于Chitinibacter菌屬。向NCBI提交該基因組序列，申請(qǐng)的登錄號(hào)為：KJ676516。根據(jù)Blast結(jié)果，選擇有代表性的菌株序列，用軟件Clustalx 1.83進(jìn)行序列比對(duì)，使用軟件Mega 3.1利用臨接法（Neighbor-Joinning）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)下圖3。

根據(jù)16S rDNA基因序列可以得知該菌屬變形菌綱（Proteobacteria）、奈瑟菌目（Neisseriales）、奈瑟菌科 （Neisseriaceae）、Chitinibacter屬， 命名為Chitinibacter sp.GC72。與 Sung K K[14]發(fā)現(xiàn)的Chitinibacter suncheonensis sp.SK16菌序列在NCBI有99%的相似度，是否為同一菌種尚需進(jìn)一步鑒定。

2.6 酶解產(chǎn)物分析

2.6.1 TLC法薄層層析法能在合適的展開(kāi)條件下分離不同的還原性糖。如下圖4（a）所示GlcNAc（Rf=0.593）、GlcN（Rf=0.421）及發(fā)酵液中可能存在的還原性葡萄糖（Glc，Rf=0.546）、果糖（Fru，Rf=0.531）均可通過(guò)比移值和顏色的不同區(qū)分開(kāi)來(lái)。Chitinibacter sp.GC72幾丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)產(chǎn)物的薄層層析結(jié)果如圖4（b）所示，薄層層析結(jié)果只有一個(gè)點(diǎn)，可定性判斷為GlcNAc，無(wú)其他還原性糖。

2.6.2 液相色譜檢測(cè)高效液相色譜能有效鑒定降解產(chǎn)物，并且定量測(cè)定出轉(zhuǎn)化率，是目前檢測(cè)還原性糖最常用的定量方法。液相結(jié)果圖5顯示，GlcNAc標(biāo)準(zhǔn)品和酶解產(chǎn)物的保留時(shí)間均為6.483 min，峰的對(duì)稱(chēng)性良好，無(wú)雜峰，可以說(shuō)明該菌降解粉粒幾丁質(zhì)的產(chǎn)物為GlcNAc。經(jīng)多次酶解實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)利用3.44 U酶液在（36±1）℃溫度下，無(wú)菌轉(zhuǎn)化27 h反應(yīng)可水解200 mg幾丁質(zhì)至159.2 mg GlcNAc，收率達(dá)79.6%。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)下表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該菌發(fā)酵所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶能快速降解幾丁質(zhì)，轉(zhuǎn)化條件溫和，環(huán)境友好，且獲得的產(chǎn)物較為單一的N-乙酰-D-氨基葡萄糖，具有良好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

2.6.3 質(zhì)譜檢測(cè)在液相實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，截取產(chǎn)物出峰時(shí)間段的流出液進(jìn)行質(zhì)譜分析。結(jié)果顯示，相對(duì)分子質(zhì)量為 244.08（GlcNAc+Na）、260.05（GlcNAc+K）、465.17（（GlcNAc）2+Na）的峰均為N-乙酰-D-氨基葡萄糖，無(wú)幾丁二糖（MW=424.4）可以判斷該菌所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)的產(chǎn)物均為N-乙酰-D-氨基葡萄糖，產(chǎn)物單一。

圖3 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Neighbor-joining tree resulting from analysis of the 16Sr DNA gene sequences

圖4 TLC檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Results of TLC

3 結(jié)語(yǔ)

利用細(xì)菌形態(tài)學(xué)、理化性狀、分子生物學(xué)手段綜合分析才能準(zhǔn)確的對(duì)未知菌株進(jìn)行種屬劃分。菌株 Chitinibacter sp. GC72 與 Chitinibacter suncheonensis sp.SK16和 Chitinibacter tainanensis strain BCRC 17254在同源樹(shù)上距離較近，但是菌株具 體 的 性 質(zhì) 卻 有 所 不 同 。 Chitinibacter suncheonensis sp.SK16菌株的發(fā)酵參數(shù)及酶學(xué)性質(zhì)研究尚未報(bào)道，Chitinibacter tainanensis strain BCRC 17254菌上存在的幾丁質(zhì)降解因子 “CDF”[15]在Chitinibacter sp.GC72菌的發(fā)酵過(guò)程中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。

圖5 UHPLC檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Results of UHPLC

表3 酶解反應(yīng)實(shí)驗(yàn)Table 3 Experiment of enzymatic hydrolysate

從降解產(chǎn)物為N-乙酰-D-氨基葡萄糖的結(jié)果可以推斷出，Chitinibacter sp.GC72所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶應(yīng)為復(fù)合酶系，β-N-乙酰氨基己糖苷酶酶活較高，但是其具體的酶學(xué)性質(zhì)仍需要下一步研究[16]。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)利用Chitinibacter sp.GC72發(fā)酵產(chǎn)酶降解幾丁質(zhì)可獲得純度非常高的N-乙酰-D-氨基葡萄糖，且轉(zhuǎn)化條件溫和，降解效率高，具有巨大的工業(yè)生產(chǎn)潛力。但是由于幾丁質(zhì)的降解產(chǎn)物為N-乙酰-D-氨基葡萄糖，且轉(zhuǎn)化體系的pH和溫度非常適宜菌體的生長(zhǎng)，故在轉(zhuǎn)化過(guò)程中的無(wú)菌操作是必須的。此外，根據(jù)酶解實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推斷該酶具有底物抑制現(xiàn)象，是否具有產(chǎn)物抑制現(xiàn)象尚待進(jìn)一步研究。

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Isolation and Characterization of a Chitin-Degrading Strain Chitinibacter sp. GC72 and Identification of its Chitinase Degradation

GAO Cong1， ZHANG Alei2， CHEN Kequan2， HAO Zhikui3， TONG Junmao*1
（1.Food College，Shihezi University，Shihezi 832003，China；2.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 211800，China；3.Institute of Applied Biotechnology，Taizhou Vocational and Technical College，Taizhou 318000，China）

A novel chitin-degrading aerobe，Chitinibacter sp.GC72，was isolated from a soil sample from Nanjing，and was proved to have high chitinolytic activity.The enzyme activity could reach to 2 835 U/g at 72 h of culture time，and one liter fermentation liquid contained 910 U chitinase.Its chitinase hydrolyzate，further investigated by TLC、UHPLC、Q-TOF-MS，was confirmed as GlcNAc. In the experiments of chitin hydrolyzation，the GlcNAc yield was 79.6%by using 3.44 U chitinase to hydrolyze chitin（200 mg）in 27 h.

Chitinibacter sp.GC72，strain identification，chitinase，degradation product，GlcNAc

Q 55

A

1673—1689（2015）01—0015—06

2014-06-09

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目（2014AA021703）。

*通信作者：童軍茂（1963—），男，新疆石河子人，教授，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工及果蔬保鮮研究。E-mail：tjm9988@163.com