龔 毅，范 偉，張 瑩，侯 炬，郭江福，柳 楊

(1.遵義醫(yī)學(xué)院研究生院，貴州遵義 563003；2.貴州省人民醫(yī)院急診外科，貴陽 550002；3.貴州省人民醫(yī)院肝膽外科，貴陽 550002)

論著·基礎(chǔ)研究

銀杏葉提取物對大鼠非酒精性脂肪肝炎肝臟保護(hù)作用的研究*

龔 毅1，范 偉2△，張 瑩3，侯 炬1，郭江福2，柳 楊2

(1.遵義醫(yī)學(xué)院研究生院，貴州遵義 563003；2.貴州省人民醫(yī)院急診外科，貴陽 550002；3.貴州省人民醫(yī)院肝膽外科，貴陽 550002)

目的觀察銀杏葉提取物對非酒精性脂肪肝炎大鼠Toll樣受體4(TLR4)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等表達(dá)的影響。方法雄性SD大鼠分為3組。對照組正常飲食，模型組、治療組給予高脂飼料喂養(yǎng)16周誘發(fā)脂肪性肝炎后分別以生理鹽水、銀杏葉提取物液10 mL/kg灌胃，每日1次，共8周。處死大鼠，分別進(jìn)行如下檢測:(1)觀察肝臟病理變化；(2)檢測TLR4表達(dá)水平；(3)檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平及血清TNF-α水平。結(jié)果(1)治療組和模型組均有不同程度的肝細(xì)胞脂肪變性，且治療組輕于模型組。 (2)模型組、治療組TLR4 mRNA及蛋白、TNF-α表達(dá)高于對照組，模型組又高于治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對照組血清ALT、AST明顯低于模型組及治療組，治療組又低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論銀杏葉提取物對非酒精性脂肪肝炎大鼠有較好的肝臟保護(hù)作用，其可能機(jī)制與降低TLR4的表達(dá)、抑制炎性反應(yīng)有關(guān)。

銀杏葉提取物；脂肪肝；Toll樣受體；腫瘤壞死因子α

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是代謝綜合征累及肝臟的表現(xiàn)。隨著現(xiàn)代生活水平的提高，非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的發(fā)病率增高，由其引起的肝纖維化和肝硬化發(fā)病率也有上升趨勢[1-3]，探討其發(fā)病機(jī)制是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)問題。黃酮類化合物和銀杏內(nèi)酯是銀杏葉提取物[4](EGb)的主要成分，藥理作用非常廣泛，具有調(diào)節(jié)脂肪代謝及抗氧化等相關(guān)作用，且其主要成分黃酮化合物還有清除自由基等作用[5-6]。本研究通過探討銀杏葉提取物對Toll樣受體4(TLR4)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等在非酒精性脂肪肝炎大鼠肝臟表達(dá)的影響，探討其對非酒精性脂肪肝炎的肝保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 30只雄性SD大鼠由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，體質(zhì)量(150±10)g。分為對照組、模型組、治療組3組，每組10只，大鼠自由進(jìn)水進(jìn)食，分籠(每籠5只)飼養(yǎng)于溫度(20±2)℃，明暗各12 h的動物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。對照組為正常飲食組(飼料中碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)分別占65．5%、10．3%、24．2%)、模型組和治療組為高脂飲食組[7-9](飼料中88%普通飼料+10%豬油+2%膽固醇，碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)分別占總熱量的53%、27．4%、19．6%)。模型組、治療組給予高脂飼料喂養(yǎng)16周誘發(fā)脂肪性肝炎后分別以生理鹽水、銀杏葉提取物液(其中含黃酮24．8%，廣西桂林思特新技術(shù)公司)10 mL/kg灌胃，每日1次，共8周。給大鼠腹腔注射水合氯醛3 mL/kg，采集肝組織標(biāo)本及下腔靜脈采血后處死。

A:對照組；B:模型組；C:治療組。

圖3 小鼠肝臟HE染色(×200)

表1 各組大鼠ALT、AST、TNF-α、TLR4水平

1.2 方法

1.2.1 肝組織標(biāo)本的制備和觀察 用多聚甲醛固定肝組織后，制備石蠟切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組肝細(xì)胞脂肪變性程度、炎癥活動度。

1.2.2 TLR4 mRNA表達(dá)情況 Taq酶、DNaseI(RNase free)購自寶生物公司(TaKaRa)，M-Mulv Reverse Transcriptase購自普洛麥格生物技術(shù)有限公司(Promega)，RNA提取試劑Tripure reagent為羅氏公司(ROCHE)產(chǎn)品,其余均為國產(chǎn)分析純試劑。所用PCR引物均由威斯騰生物技術(shù)公司合成。取材:分別快速取每組樣品的組織約25 mg，按說明書操作提取RNA后。所用引物，TLR4:5′-TCT GCC CTG CCA CCA TTT ACA CAG GTC TAA AGA GAG ATT GAC-3′，697 bp，PCR反應(yīng)條件94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 50 s,35個循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。Actin:5′-CAC CCG CGA GTA CAA CCT TC；CCC ATA CCC ACC ATC ACA CC PCR-3′，207 bp反應(yīng)條件94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35個循環(huán);72℃延伸10 min;4 ℃保存。Marker是TaKaRa的DL2000 取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8 μL，在1.0%的瓊脂糖上進(jìn)行凝膠電泳。采用凝膠成像系統(tǒng)獲取各樣品電泳圖。

1.2.3 肝臟組織TLR4檢測 按ELISA試劑盒說明檢測大鼠肝臟組織 TLR4水平。

1.2.4 血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、TNF-α水平檢測 采用全自動生物化學(xué)分析儀檢測血清ALT、AST水平，采用放射免疫分析法檢測血清TNF-α水平。

2 結(jié) 果

2.1 模型組大鼠造模均成功，對照組肝臟顏色紅潤，質(zhì)軟。模型組和治療組肝臟腫脹，色澤偏黃，質(zhì)脆。鏡下對照組可見肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞呈放射狀排列。模型組和治療組肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，肝細(xì)胞排列紊亂，均有不同程度的肝細(xì)胞空泡脂肪變性，治療組肝細(xì)胞脂肪變性明顯輕于模型組,見圖1。

A:對照組；B:模型組；C:治療組。

圖2 各組肝臟TLR4 mRNA的表達(dá)情況

2.2 各組TLR4 mRNA的表達(dá) 模型組的TLR4 mRNA的表達(dá)明顯高于對照組,治療組又低于模型組，見圖2。

2.3 各組大鼠ALT、AST、TNF-α、TLR4水平比較 對照組ALT、AST、TNF-α水平、TLR4表達(dá)明顯低于模型組和治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

3 討 論

TLR是近年來發(fā)現(xiàn)的一種脂多糖受體，其家族成員目前已確認(rèn)的有10個(TLR 1～10)。其中，TLR2和TLR4為主要成員，TLR2主要介導(dǎo)細(xì)菌外毒素所致的炎癥反應(yīng)，TLR4主要介導(dǎo)細(xì)菌內(nèi)毒素所致的炎癥反應(yīng)。當(dāng)脂多糖經(jīng)級聯(lián)活化反應(yīng)激活TLR4后，其胞內(nèi)Toll/IL-1R(TIR)結(jié)構(gòu)域招募一系列信號分子，活化核因子(NF)-κB，引起以TNF-α等為主的核心促炎因子的炎癥因子級聯(lián)反應(yīng)，形成第二次打擊力量，導(dǎo)致機(jī)體損傷[10-12]。在其信號傳導(dǎo)通路中TNF-α起著極為重要的作用，TNF-α可抑制脂蛋白的脂質(zhì)活性，目前的研究表明高濃度的TNF-α可降低外周組織的脂肪分解，促進(jìn)肝細(xì)胞對三酰甘油的合成與聚集，而富余脂質(zhì)特別是三酰甘油在肝臟中的沉積是NAFLD形成和發(fā)展的前提條件。既往的研究表明，血清內(nèi)毒素水平升高與TNF-α水平呈顯著正相關(guān)[13-15]。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過持續(xù)16周的高脂飲食喂養(yǎng)，大鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)明顯升高，病理形態(tài)形成NASH。治療組和模型組均有不同程度的肝細(xì)胞脂肪變性，治療組肝細(xì)胞脂肪變性輕于模型組。模型組、治療組TLR4 mRNA及蛋白表達(dá)、TNF-α表達(dá)高于對照組，模型組又高于治療組。對照組血清ALT、AST明顯低于模型組及治療組，治療組又低于模型組。表明銀杏葉提取物對非酒精性脂肪肝炎大鼠有較好的肝臟保護(hù)作用，其可能機(jī)制與降低TLR4的表達(dá)、抑制炎性反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，TRL4介導(dǎo)的炎性反應(yīng)可能是導(dǎo)致非酒精性脂肪肝大鼠肝臟炎癥、肝功能損傷的原因之一。銀杏葉提取物對肝臟的保護(hù)作用可能與其降低TLR4的表達(dá)、抑制炎性反應(yīng)有關(guān)。

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總體與樣本

根據(jù)研究目的確定的同質(zhì)研究對象的全體(集合)稱為總體，包括有限總體和無限總體。從總體中隨機(jī)抽取的部分觀察單位稱為樣本，樣本包含的觀察單位數(shù)量稱為樣本含量或樣本大小。如為了解某地區(qū)10～15歲兒童血鈣水平，隨機(jī)選取該地區(qū)3 000名10～15歲兒童并進(jìn)行血鈣檢測，則總體為該地區(qū)所有10～15歲兒童的血鈣檢測值，樣本為所選取3 000名兒童的血鈣檢測值，樣本含量為3 000例。類似的研究需滿足隨機(jī)抽樣原則，即需要采用隨機(jī)的抽樣方法，保證總體中每個個體被選取的機(jī)會相同。

Protective effect of ginkgo biloba extract on liver nonalcoholic steatohepatitis rats*

GongYi1,FanWei2△,ZhangYing3,HouJu1,GuoJiangfu2,LiuYang2

(1.GraduateSchool,ZunyiMedicalCollege,Zunyi,Guizhou563003,China;2.DepartmentofEmergencySurgery,GuizhouProvincialPeople′sHospital,Guiyang,Guizhou550002,China;3.DepartmentofHepatobiliarySurgery,GuizhouProvincialPeople′sHospital,GuiYang,Guizhou550002,China)

Objective To observe the effect of ginkgo biloba extract on the expression of TLR4 and TNF-α in rat nonalcoholic steatohepatitis.MethodsSD rats were randomly divided into three groups:control group (normal diet),rats in the model group and the treatment group was given high fat diet to induce steatohepatitis for 16 weeks,respectively.Rats in model group were treated with normal saline,rats in treatment group was fed ginkgo biloba extract (10 mL/kg per day,for eight weeks).Then rats were sacrificed,the following tests were performed:(1)The pathological changes in liver;(2)the expression level of TLR4;(3)serum ALT,AST levels and serum TNF-α levels.Results(1)Both treatment group and model group have different levels of hepatic steatosis,and it was lighter in the treatment group.(2)TLR4 mRNA and its protein and TNF-α expression in model group and treatment group were higher than that of the control group,and the model group was higher than the treatment group,the difference was statistically significant.Serum ALT and AST was significantly lower in control group than the model group and the treatment group,the treatment group was lower than model group,the difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionGinkgo biloba extract has good protection effect on nonalcoholic steatohepatitis in rats,and the possible mechanism may be the reduction of the expression of TLR4 and the inhibition of inflammatory reaction.

ginkgo biloba extract;fatty liver;Toll-like receptor 4;TNF-α

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.30.005

貴州省省長基金[黔科教辦(2007)04]；貴州省科技廳基金[黔科合J(2008)2301]；貴州省科技廳專項(xiàng)基金[黔科合J(2008)-2302號]；貴州省優(yōu)秀青年科技人才基金[黔科合人字(2011)29號]。

:龔毅(1989-)，碩士，住院醫(yī)師，主要從事肝膽方向的研究。△

，Tel:13985409773；E-mail:guodongliu777@sina.com。

R657.3

A

1671-8348(2015)30-4190-03

2015-03-08

2015-05-16)