劉美+張鳳+楊翠翠+楊文思+孫慶泉

摘要：為研究小麥種子萌發(fā)早期淀粉降解關鍵酶活性及其基因表達量變化，以山農17為試驗材料，測定了不同溫度條件下萌發(fā)的小麥種子中的淀粉、可溶性糖含量及相關酶（淀粉酶和淀粉磷酸化酶）活性，并采用實時熒光定量PCR技術測定各酶相關基因相對表達量。結果顯示，不同溫度條件下萌發(fā)的小麥種子，淀粉含量隨萌發(fā)進程以不同的速率呈下降趨勢，可溶性糖含量呈先下降后上升趨勢，α-淀粉酶、淀粉磷酸化酶活性和呼吸速率整體呈上升趨勢，以上各指標均在露白前后有明顯的變化；β-淀粉酶呈現(xiàn)雙峰變化趨勢，且一直保持較高活性；α-淀粉酶和淀粉磷酸化酶基因的相對表達量均呈上升趨勢，且與酶活性呈極顯著相關。以上結果表明，在小麥種子萌發(fā)早期，溫度能強烈影響萌發(fā)過程中淀粉降解關鍵酶基因的表達量；α-淀粉酶和淀粉磷酸化酶在種子置床初期即可被檢測到活性，且受其編碼基因的調控作用顯著，在種子萌發(fā)過程中具有重要作用。

關鍵詞：淀粉代謝； 淀粉酶； 淀粉磷酸化酶； 熒光定量PCR； 基因表達

中圖分類號：S512.1+1文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）09-0039-07

萌發(fā)是植物生長發(fā)育的前提，關系到作物后續(xù)生長，乃至最終產量[1]。影響種子正常萌發(fā)的因素很多，包括內部生理條件和外部環(huán)境條件，其中，溫度強烈影響萌發(fā)種子內部酶活性和物質代謝，進而影響發(fā)芽率和萌發(fā)速率[2]。

目前，對種子萌發(fā)代謝的研究已從傳統(tǒng)的生理生化水平深入到基因組及蛋白質組水平[3]。但諸類深層次的研究大多集中于大麥、番茄以及模式植物擬南芥，且主要針對種子萌發(fā)后期的代謝變化，對萌發(fā)初期的研究甚少[4，5]。Weitbrecht等[6]指出對種子萌發(fā)早期（介于干燥種子和胚突破種皮后幼苗建成階段之間）內部代謝事件進行研究，對于完善種子萌發(fā)的機理具有重要意義。

淀粉降解是小麥種子萌發(fā)過程中主要的物質代謝，其代謝產物為種子萌發(fā)提供必需的養(yǎng)料和能量[7]。關于淀粉降解及其相關酶的研究已有諸多報道[8]。然而，在基因水平層面的研究多集中在種子發(fā)育過程中的淀粉合成部分[9，10]，對萌發(fā)過程中淀粉降解關鍵酶基因表達量的研究不多。因此，本研究以當?shù)匦←溒贩N山農17為試驗材料，測定了不同溫度條件下萌發(fā)早期（介于干燥種子和胚突破種皮后幼苗建成階段之間）淀粉和可溶性糖含量、淀粉降解關鍵酶活性及其基因相對表達量變化，旨在探究種子萌發(fā)早期淀粉降解的酶學變化和基因轉錄調節(jié)變化，以期為進一步闡明小麥種子萌發(fā)機理提供基礎數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與設計

以小麥品種山農17為試驗材料，2012年收獲于山東農業(yè)大學試驗站。

發(fā)芽共設置3個溫度處理（最適溫度20℃、高溫30℃、低溫10℃）。取樣時間分布在萌發(fā)前、露白至發(fā)芽三個階段。具體取樣時間：30℃下萌發(fā)的種子每隔4 h取樣；20℃和10℃條件下萌發(fā)的種子每隔8 h取樣，直到發(fā)芽結束（胚芽長度為種子一半）時停止取樣。此外，20℃和10℃條件下，在露白時各增加一次取樣（20℃、12 h，10℃、40 h）。發(fā)芽前將種子含水量調整到12.5%（以減少種子本身對結果造成的差異），用5%H2O2消毒2～3 min，再用去離子水沖洗5～6遍后選取100粒籽粒飽滿、大小均一的種子，整齊的擺放到發(fā)芽盒，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天適量補水并按時取樣。重復3次。用于RNA提取的材料保存于液氮中，用于酶活性測定的材料液氮速凍后放入-20℃冰箱中備用

1.2試驗方法

1.2.1測定方法淀粉含量參考雙波長法測定[11]；可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定[12]；α-淀粉酶、β-淀粉酶及總淀粉酶活性參考3，5-二硝基水楊酸法測定[13]；淀粉磷酸化酶活性采用無機磷釋放定量分析法測定[14]。

1.2.2小麥籽?？俁NA的提取、質量檢測及反轉錄總RNA的提取、質量檢測參考李浩等的方法[15]。cDNA合成按照寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）反轉錄試劑盒說明書進行，反轉錄后的cDNA保存于-20℃冰箱備用。

1.2.3熒光定量PCR用于目標基因表達分析的引物序列（表1）來源于參考文獻或利用Primer 6軟件設計，通過NCBI進行Blast同源比對后由上海生工生物工程有限公司合成。各酶基因表達量分析采用實時熒光定量PCR，反應采用寶生物試劑盒（SYBR Premix Ex TaqTM），反應體系為20 μL。

2結果與分析

2.1總RNA純度及完整性檢測

經瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1），加樣孔中無明顯亮帶，表明無蛋白質污染?？俁NA的28S rRNA和18S rRNA條帶清晰，且條帶亮度比約為2∶1，5S條帶較弱，說明總RNA的完整性較好，無明顯降解。

2.2熒光定量PCR引物的特異性

熒光定量PCR的擴增曲線符合“S”形熒光增長曲線（圖2），目的基因及內參基因擴增的動力學曲線平行性較好，曲線拐點清楚。熔解曲線集中，只有1個明顯峰，目的基因與內參基因擴增產物的Tm值均一，表明在實時熒光定量PCR過程中，各基因擴增產物具有特異性，無非特異性擴增及引物二聚體出現(xiàn)。

2.3種子萌發(fā)過程中淀粉及可溶性糖含量的變化

2.3.1淀粉含量變化由圖3A、B、C可知，不同萌發(fā)溫度條件下兩種類型淀粉及總淀粉含量均逐漸下降，總體趨勢相似，萌發(fā)溫度越高，下降速率越大，且均在露白（箭頭標出）時表現(xiàn)出較大幅度下降。但不同溫度下種子消耗淀粉的總量不同，表現(xiàn)為10℃>30℃>20℃，說明溫度過高或過低均要消耗較多的淀粉。各類型淀粉的總變化量也不同，直鏈淀粉下降總量表現(xiàn)為30℃>10℃>20℃，支鏈淀粉則表現(xiàn)為10℃>20℃>30℃，說明較高溫度下直鏈淀粉消耗較多，低溫條件下支鏈淀粉較易分解。露白時，20℃和30℃下萌發(fā)的種子直鏈淀粉含量相差不大，均高于10℃下萌發(fā)的種子直鏈淀粉含量，支鏈淀粉和總淀粉呈相同的規(guī)律。

2.3.2可溶性糖含量變化由圖3D可知，不同溫度下萌發(fā)的小麥種子可溶性糖均呈現(xiàn)先降低后升高趨勢，趨勢改變的轉折點均在露白處?？傮w來看，從置床到種子萌發(fā)結束，不同溫度條件下萌發(fā)的小麥種子，其可溶性糖含量變化幅度相差不大，即可溶性糖的最低含量稍高者，其最高含量也稍高些。種子可溶性糖含量在下降過程中表現(xiàn)為萌發(fā)溫度越高，含量下降越快；在上升過程中則表現(xiàn)為萌發(fā)溫度越高，含量上升越快。露白時，10℃和20℃下萌發(fā)的種子中可溶性糖含量相差不大，均略低于30℃下萌發(fā)的種子。這與萌發(fā)溫度越高，種子內部的代謝越活躍有關。

2.4種子萌發(fā)過程中呼吸速率的變化

種子萌發(fā)過程呼吸作用的底物為淀粉降解的一些可溶性糖類，因此，萌發(fā)過程中呼吸速率可在一定程度上反映淀粉代謝強度。由圖4可知，不

同溫度條件下萌發(fā)的種子，其呼吸速率總體均呈上升趨勢。但不同萌發(fā)溫度條件下的種子在相同萌發(fā)時間表現(xiàn)為萌發(fā)溫度越高，種子呼吸作用越強，且整體變化幅度越大，上升速率越快，即30℃>20℃>10℃。呼吸速率在種子露白前一時期就已呈現(xiàn)明顯變化，比淀粉及可溶性糖含量明顯變化的時間點早一個時期，說明呼吸作用加速

了淀粉的降解。到種子露白時，不同萌發(fā)溫度條件下種子的呼吸速率相差不大，但到萌發(fā)結束時，各萌發(fā)溫度下的種子呼吸速率差別增大，30℃下的與20℃差異要明顯小于20℃與10℃的差異，說明低溫條件嚴重影響種子的呼吸速率及能量代謝，進而延長種子萌發(fā)完成所需要的時間。

2.5種子萌發(fā)過程中淀粉降解酶的活性變化

2.5.1α-淀粉酶活性由圖5A可知，不同溫度條件下萌發(fā)的種子α-淀粉酶活性均呈上升趨勢，且在露白處出現(xiàn)明顯上升。在萌發(fā)結束時，除30℃條件下萌發(fā)的種子淀粉酶活性略有降低外，其它溫度條件下均有趨于穩(wěn)定的趨勢。不同溫度下，在相同萌發(fā)時間α-淀粉酶活性表現(xiàn)出溫度越高，酶活性越高的規(guī)律，即30℃>20℃>10℃，種子露白時不同溫度條件下α-淀粉酶活性表現(xiàn)為10℃>30℃>20℃，但到發(fā)芽結束時酶活性差異不大。

2.5.2β-淀粉酶活性由圖5B可知，β-淀粉酶活性在不同溫度條件下隨萌發(fā)進程整體呈現(xiàn)不同的變化趨勢，其中，20℃下萌發(fā)的種子呈先上升后下降的單峰變化，而10℃和30℃條件下的種子

則呈上升下降后又上升下降的雙峰變化趨勢。種子露白時，萌發(fā)溫度越高β-淀粉酶活性越大，但不同溫度條件下的最大峰值相差不大，且均在露白后出現(xiàn)。種子萌發(fā)結束時，β-淀粉酶活性下降至最低點。整個萌發(fā)過程（包括干種子）中β-淀粉酶都具有較高的活力，這可能與種子中預存無活性的β-淀粉酶聚合體有關。

2.5.3淀粉磷酸化酶活性由圖6可知，淀粉磷酸化酶活性隨種子萌發(fā)進程逐漸上升，且均在露白時出現(xiàn)明顯上升。不同溫度條件下，淀粉磷酸化酶活性在相同萌發(fā)時間表現(xiàn)出溫度越高、酶活性越高的規(guī)律，即30℃>20℃>10℃。但在種子露白及萌發(fā)結束時，不同溫度條件下萌發(fā)的種子酶活性相差不大，且除20℃條件下萌發(fā)的種子以外，其它條件下萌發(fā)的種子酶活性趨于穩(wěn)定，說明淀粉磷酸化酶在整個萌發(fā)早期具有重要作用，到萌發(fā)結束時酶作用可能已達到最大值。

2.6不同淀粉降解酶基因的相對表達量變化

2.6.1α-淀粉酶基因α-Amy1-2表達量由圖7A可以看出，不同溫度條件下α-淀粉酶基因α-Amy1-2相對表達量不同，10℃和20℃條件下，基因表達量整體呈上升趨勢，且均在露白處明顯上升，接近發(fā)芽結束時趨于穩(wěn)定表達；30℃條件下，基因表達量先上升，置床至20 h后又有所下降。不同萌發(fā)溫度條件下，該基因在露白和發(fā)芽結束時相對表達量表現(xiàn)出溫度越低，上調越明顯，即10℃>20>30℃，但發(fā)芽結束時相對表達量的差距比露白時增大，尤其10℃下萌發(fā)的種子基因表達量上調幅度很大。此外，經相關性分析發(fā)現(xiàn)，α-淀粉酶基因表達量與酶活性變化具有極顯著的相關性，相關系數(shù)為0.84，說明該基因對酶活性的調控具有重要的作用。

2.6.2β-淀粉酶基因β-Amy表達量由圖7B可以看出，不同溫度條件下該基因表達量總體變化趨勢不同。30℃和10℃條件下萌發(fā)的種子，β-Amy基因表達量均呈現(xiàn)先上升后下降、再上升又下降的雙峰趨勢，且第一次的峰值及最低點均出現(xiàn)在露白前，第二個峰值出現(xiàn)在露白后不久，之后表達量逐漸下降，至萌發(fā)結束時低于未萌發(fā)時的表達量。20℃條件下萌發(fā)的種子基因表達量呈先上升后下降的單峰形式，但在露白前有一緩慢上升階段，最高峰出現(xiàn)在露白后4 h，之后表達量逐漸下降至萌發(fā)結束時低于未萌發(fā)時的表達量，這說明β-Amy基因主要在種子露白結束后的一個時期之前明顯表達。雖然不同溫度條件下基因的表達量總體變化趨勢不同，但在種子露白及萌發(fā)結束時，基因表達量相差不大。此外，經相關性分析發(fā)現(xiàn)，該基因的表達量與β-淀粉酶活性變化沒有明顯的相關性，但是兩者變化曲線趨勢相似，只是在時間進程上有所差別。

2.6.3淀粉磷酸化酶基因SP-cyt/Pho-H表達量由圖8可知，不同溫度條件下萌發(fā)的小麥

種子在萌發(fā)早期，其SP-cyt/Pho-H型淀粉磷酸化酶基因表達量隨種子萌發(fā)進程整體均呈上升趨勢，且在露白處出現(xiàn)明顯上升；但萌發(fā)溫度越高，在相同萌發(fā)時間基因表達量越高，即30℃>20℃>10℃。30℃條件下萌發(fā)的種子到最后兩個時期基因表達量上升緩慢；10℃條件下在萌發(fā)結束時略有下降，但仍高于最初種子未置床時的表達量；20℃條件下則在發(fā)芽前8 h時表達量出現(xiàn)下降，后又迅速上升。到萌發(fā)結束時，30℃和10℃條件下該基因表達量相差不大，但均小于20℃下基因表達量。此外，經相關性分析發(fā)現(xiàn)，該基因表達量與淀粉磷酸化酶活性變化具有極顯著的相關性，相關系數(shù)為0.93，說明該基因對酶活性的調控具有重要的作用。

3結論與討論

溫度能強烈影響酶活性、呼吸作用及物質轉化等過程，從而影響種子萌發(fā)質量，在適宜的溫度條件下種子才能既快又好的萌發(fā)。本試驗結果顯示，30℃、20℃和10℃條件下小麥種子萌發(fā)至結束所用時間分別為28、40、112 h，充分體現(xiàn)了溫度對萌發(fā)進程的影響。

種子萌發(fā)過程中，可溶性糖由淀粉等高分子多糖降解產生，同時又作為呼吸底物被消耗，使得可溶性糖含量與淀粉降解速率和呼吸消耗速率有關，含量變化趨于復雜化。有研究表明，可溶性糖含量在種子萌發(fā)過程中處于動態(tài)平衡中[18]。本試驗結果顯示的變化趨勢可能與萌發(fā)初期呼吸酶系統(tǒng)、淀粉降解酶系統(tǒng)活化順序及細胞膜功能恢復狀態(tài)有關。此外，較高的可溶性糖含量可增強種子抵御寒冷的能力[19]，這可能是萌發(fā)24 h內，10℃條件下萌發(fā)的種子其可溶性糖含量下降較慢的一個原因。

淀粉酶對淀粉的降解作用與萌發(fā)溫度有較大關系，且與作物種子類型有關。Wijngaard等[20]對以蕎麥為材料研究表明低溫（16.5℃）下發(fā)芽時α-淀粉酶的活性最高。不同作物種子如水稻[21]干種子胚中具有較高的α-淀粉酶活性。本試驗結果顯示，高溫（30℃）條件下萌發(fā)的小麥種子其α-淀粉酶的活性最高，整體呈逐漸上升的趨勢。β-淀粉酶在籽粒發(fā)育和成熟過程中形成，以無活性的聚合體形式貯藏于干種子中，在萌發(fā)時逐步釋放激活[8]，這可能是本試驗中β-淀粉酶在置床不久就表現(xiàn)出較高活性的原因。淀粉磷酸化酶既催化淀粉降解又參與淀粉合成，反應方向由底物相對濃度決定[22]。但在植物淀粉粒內，由于植物細胞中反應底物無機磷濃度比產物葡萄糖-1-磷酸幾乎高了兩個數(shù)量級，該酶主要負責淀粉降解，且酶活性隨著萌發(fā)進程逐漸升高[23]，與本試驗結果相同。此外本研究還發(fā)現(xiàn)，該酶活性隨種子萌發(fā)溫度上升而升高。

文迪[23]指出，在編碼β-淀粉酶的兩個同工酶基因[β-amylase和β-amylase （5amy）]中，β-amylase基因在籽粒中有表達，是籽粒β-淀粉酶的主要調控基因。本研究中β-Amy基因表達量變化與酶活性變化雖然無顯著相關性，但兩者變化規(guī)律相似，即酶活性變化均滯后于基因表達量變化一個時期左右，這說明該基因對β-淀粉酶活性具有一定的調控作用。Schupp等[24]指出質體型Pho-L基因在小麥種子萌發(fā)過程中表達量相當?shù)?，Pho-H型淀粉磷酸化酶蛋白存在于在萌發(fā)的小麥種子胚中，本研究結果表明，該酶基因表達量相對于未置床種子的上調幅度隨萌發(fā)進程而增大。萌發(fā)結束時，萌發(fā)溫度越低，基因表達量越高，而此時所對應的酶活性相差不大（這與本研究結果中α-淀粉酶基因與酶活性的關系相似），由此可以在轉錄水平上說明淀粉磷酸化酶對小麥種子萌發(fā)早期淀粉的降解具有重要作用。

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