楊申明，王振吉，韋 薇，何明華

1楚雄師范學院化學與生命科學院;2云南省高校應用生物學重點實驗室，楚雄 675000

天花粉是葫蘆科植物栝樓(Trichosanthes kirilowii Maxim)的干燥塊根［1］，它是一種藥食同源的植物，廣泛分布于云南各地。天花粉又稱瑞雪(《本草綱目》)，栝樓粉、樓粉(《藥材學》)，屎瓜粉(《四川中藥學》)，性味苦、甘、酸、涼，它是臨床中常用的中草藥，具有清熱生津，消腫排膿，抗癌之功效［2］。天花粉藥用價值很高，常用于治療熱病煩渴，肺熱燥咳，內(nèi)熱消渴等病證，具有很好的療效。據(jù)文獻報道，栝樓屬植物的化學成分主要有油脂和有機酸類、黃酮類、三萜、甾體類及甾醇、蛋白質(zhì)等［3］。

黃酮類化合物具有清除自由基、抗氧化、抗癌、抗菌、抗過敏、抗病毒等［4］多種生物活性及藥理作用，很可能是天花粉抗癌作用的有效成分之一。目前，有關(guān)天花粉中總黃酮含量測定方面的研究未見報道。本研究對天花粉中總黃酮進行提取、定性鑒定和含量測定，并對提取工藝進行優(yōu)化，旨在為天花粉的綜合利用提供參考。

1 材料與儀器

天花粉，采自云南省雙柏縣妥甸鎮(zhèn)，經(jīng)楚雄師范學院化學與生命科學系王振吉博士鑒定為葫蘆科植物栝樓的塊根;蘆丁對照品(純度＞98%)，由成都思科華生物技術(shù)有限公司生產(chǎn);無水乙醇、甲醇、硝酸鋁、氫氧化鈉、鎂粉、亞硝酸鈉、三氯化鋁、濃鹽酸、濃硫酸等均為分析純;實驗用水為蒸餾水;所用儀器均經(jīng)自來水，蒸餾水清洗備用。

722S 可見分光光度計(上海青華科技儀器有限公司生產(chǎn))，CP214C 電子天平(奧豪斯儀器有限公司制造)，HH-S2 恒溫水浴鍋(金壇市大地自動化儀器廠制造)，搖擺式植物粉碎機，202-00 型電熱恒溫干燥箱(上海市崇明實驗儀器廠制造)，格蘭仕G823YL-V1 型微波爐，SHZ-ⅢA 型循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司生產(chǎn))等。

2 試驗方法

2.1 試驗材料的處理

將采集到的天花粉依次用自來水、蒸餾水洗凈后切成小片，置于50 ℃恒溫干燥箱中烘干至恒重，用搖擺式植物粉碎機研碎后過60 目篩，得天花粉干粉。將天花粉干粉用折疊成筒狀的濾紙裝好，加入150 mL 石油醚冷浸48 h，然后將其置于75 ℃水浴中，使其微沸回流反復提取，直至提取液澄清為止，取出冷卻至室溫。減壓抽濾，濾渣用石油醚充分洗滌后，風干至石油醚全部揮發(fā)，得到去除色素和油脂的天花粉密封保存，備用。

2.2 總黃酮的提取

準確稱取2.0 g 去除色素和油脂的天花粉干粉，用30 mL 50%(體積分數(shù)，下同)甲醇，在70 ℃水浴中加熱回流90 min，過濾，濾液用50%甲醇定容至50 mL 容量瓶中，搖勻，得天花粉黃酮提取液(供試品溶液)。

2.3 總黃酮的定性鑒定［5］

各取1 mL 供試品溶液4 份于試管中，分別加4%(質(zhì)量分數(shù)，下同)NaOH，1%(質(zhì)量分數(shù))AlCl3甲醇溶液，鹽酸-鎂粉，濃硫酸進行顯色反應，觀察實驗現(xiàn)象。

2.4 總黃酮含量測定［6］

以蘆丁為標準品，采用Al(NO3)3-NaNO2比色法測定總黃酮含量。

2.4.1 蘆丁標準曲線制備

準確稱取在105 ℃干燥至恒重的蘆丁標準品10.00 mg，用50%甲醇溶解，定容至50 mL 容量瓶中，搖勻，即得0.20 mg/mL 的蘆丁對照品溶液。準確吸取對照品溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分別置于25 mL 比色管中，分別加50% 甲醇3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5、0.0 mL，各加5%(質(zhì)量分數(shù)，下同)亞硝酸鈉溶液0.30 mL，搖勻，放置6 min;加10% (質(zhì)量分數(shù)，下同)硝酸鋁溶液0.30 mL，搖勻，放置6 min;加4% 氫氧化鈉溶液4.00 mL，用50%甲醇定容至10 mL 刻度線，搖勻，放置10 min。以相應的試劑空白作參比，在440～560 nm波長處測定絡合物吸光度。結(jié)果表明，對照品液在510 nm 波長處有最大吸光度，因此選擇510 nm 作為測定波長。在510 nm 波長處測定體系的吸光度，以吸光度為縱坐標，蘆丁濃度為橫坐標，繪制標準曲線。得回歸線性方程為A=-0.00404 +11.95357C，R=0.9998。結(jié)果表明，蘆丁對照品在所試濃度0.00～0.06 mg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 天花粉總黃酮含量測定

取供試品溶液1 mL，置于25 mL 比色管中，加50%甲醇3.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液0.30 mL，搖勻，放置6 min;加10%硝酸鋁溶液0.30 mL，搖勻，放置6 min;加4%氫氧化鈉溶液4.0 mL，用50%甲醇定容至10 mL 刻度線，搖勻，放置10 min，以相應的試劑空白作參比，在510 nm 波長處測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算總黃酮含量。

樣品中總黃酮含量(mg/g)=(C ×50 ×10)/W，式中C 為提取液中總黃酮濃度;W 為樣品質(zhì)量(g)。

2.5 提取溶劑的考察

準確稱取去除色素和油脂的天花粉2.0 g 樣品3 份，分別加入60% (體積分數(shù)，下同)甲醇、60%(體積分數(shù)，下同)乙醇、水各50 mL，置于索氏提取器中，提取180 min，過濾，濾液移至50 mL 容量瓶中，用相應的溶劑定容至刻度，搖勻。分別精密吸取以上提取液1.0 mL，置于25 mL 比色管中，按標準曲線操作方法顯色后分別以相應溶劑定容至10 mL刻度，搖勻，放置10 min，再分別以相應的溶劑為空白對照，在510 nm 處測定其吸光度，計算天花粉中總黃酮含量。

2.6 提取方法的考察

準確稱取去除色素和油脂的天花粉2.0 g 樣品4 份，分別用50 mL 60%甲醇索氏提取3 h、50 mL 60%甲醇回流提取3 h、50 mL 60%甲醇微波提取5 min、50 mL 60%甲醇冷浸提取24 h，過濾，將濾液移至50 mL 容量瓶中，分別用60%甲醇定容至刻度線，搖勻。分別精密吸取以上制備液1.0 mL 置于25 mL 比色管中，按標準曲線項操作顯色后，分別以相應溶劑定容至10 mL 刻度，搖勻，放置10 min，再分別以相應的溶劑為空白對照，在510 nm 處測定其吸光度，計算天花粉中總黃酮含量。

2.7 提取工藝單因素試驗［7］

按照上述提取方法，分別考察以下單因素影響:l)選擇甲醇體積分數(shù)分別為40%、50%、60%、70%、80%作為提取溶劑進行比較，回流溫度為70℃，回流時間為90 min，料液比為1∶15;2)確定50%甲醇提取效果較好后，以50%甲醇作為提取溶劑，分別在料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 的條件下進行回流提取，回流溫度為70 ℃，回流時間為90 min;3)確定了料液比為1∶15 提取效果較好后，用料液比為1∶15，50%甲醇作為提取溶劑，分別在50、60、70、80、90 ℃溫度條件下進行回流提取，回流時間為90 min;4)確定了回流溫度為70 ℃提取效果較好后，以50%甲醇作為提取溶劑，料液比為1∶15，回流時間分別為60、90、120、150、180 min 的條件下進行回流提取，從而確定各因素的影響作用。

2.8 最佳提取工藝優(yōu)化

在單因素試驗基礎(chǔ)上，結(jié)合藥材性質(zhì)以及實際生產(chǎn)要求，以甲醇體積分數(shù)、料液比、提取溫度、提取時間為試驗考察因素，以天花粉中總黃酮含量為評價指標，設(shè)計L9(34)正交試驗探索最優(yōu)化條件。因素及水平見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design

3 結(jié)果與分析

3.1 黃酮類化合物的鑒定

加4% NaOH 的溶液顯橙紅色，說明可能有二氫黃酮、橙酮或查耳酮存在;加1% AlCl3甲醇溶液顯橙黃色，說明可能有查耳酮存在;加鹽酸-鎂粉的溶液由黃色變成紅色，說明可能有黃酮、黃酮醇或二氫黃酮存在;加濃硫酸的溶液由黃色變成橙色，說明提取液中可能有黃酮、黃酮醇、異黃酮存在。通過顯色反應，說明天花粉的提取液中含有黃酮類化合物。

3.2 提取溶劑的考察結(jié)果

提取溶劑分別為60%乙醇、60%甲醇、水，總黃酮含量分別為0.0858、0.1234、0.0488 mg/g。結(jié)果表明，甲醇的提取效果明顯高于乙醇和水的提取效果，這是因為天花粉中黃酮類化合物的極性較強，總黃酮的提取率隨溶劑親水性的增強而增大［8］。因此在后續(xù)優(yōu)化試驗中選擇甲醇作為提取溶劑。

3.3 提取方法的考察結(jié)果

提取方法分別為索氏提取、回流提取、微波提取、冷浸24 h 提取，總黃酮含量分別為0.0670、0.1172、0.0774、0.0774 mg/g。結(jié)果表明，回流提取法提取的天花粉提取液中總黃酮含量最高，因此在后續(xù)優(yōu)化試驗中選擇回流法提取。

3.4 單因素試驗的結(jié)果

3.4.1 甲醇體積分數(shù)對總黃酮提取效果的影響

如圖1A 所示。在相同條件下，天花粉中總黃酮的提取率隨甲醇濃度的增大而隨之提高，但當甲醇濃度達到50%以后，提取率有所下降?？赡苁怯捎诟邼舛燃状际辜毎麅?nèi)蛋白質(zhì)凝固，影響總黃酮的溶出［9］。故選擇甲醇體積分數(shù)為50%。

3.4.2 料液比對總黃酮提取效果的影響

如圖1B 所示。在相同條件下，天花粉中總黃酮的提取率隨著料液比的增大而提高。當料液比達到1∶15 時，提取率最高，之后隨著料液比的增大提取率呈下降趨勢。故選擇料液比為1∶15。

3.4.3 提取溫度對總黃酮提取效果的影響

如圖1C 所示。在相同條件下，天花粉中總黃酮的提取率開始時隨著溫度的升高，總黃酮提取率增加，當溫度達到70 ℃時提取率最高，之后隨著提取溫度的繼續(xù)增加，總黃酮提取率呈下降趨勢。這可能是隨著溫度的升高，分子運動加快，黃酮更容易從細胞中轉(zhuǎn)移到溶質(zhì)中。但溫度過高，使蛋白質(zhì)凝固，黃酮不易溶出，同時天花粉中有效成分會受到破壞。故選擇提取溫度為70 ℃。

3.4.4 提取時間對總黃酮提取效果的影響

如圖1D 所示。在相同條件下，天花粉中總黃酮的提取率開如時隨著提取時間的增加，總黃酮提取率提高，提取90 min 時提取率最高，之后隨提取時間的增加，總黃酮提取率呈下降趨勢，可能是長時間高溫使蛋白質(zhì)凝固，造成黃酮不易溶出。故選擇提取時間為90 min。

圖1 甲醇體積分數(shù)(A)、料液比(B)、提取溫度(C)、提取時間(D)對總黃酮提取效果的影響Fig.1 Effect of the volume fraction of methanol (A)，solid/liquid ratio (B)，extraction temperature (C)and extraction time (D)on the extraction yield of total flavonoids

3.5 天花粉總黃酮提取工藝參數(shù)優(yōu)化

正交試驗結(jié)果見2。從表2 分析可知:各因素對天花粉總黃酮提取率的影響程度不同，其影響的主次順序為C ＞D ＞A ＞B，即提取溫度＞提取時間＞甲醇體積分數(shù)＞料液比。由試驗數(shù)據(jù)可以得出:提取溫度為顯著影響因素，極差分析最優(yōu)組合是A2B2C2D2(即最佳實驗條件是:甲醇體積分數(shù)50%，料液比1∶15，浸提溫度70 ℃，回流時間90 min)。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of the orthogonal experiment

3.6 驗證試驗

準確稱取2.0 g 去除色素和油脂的天花粉樣品共5 份，在最優(yōu)工藝條件下進行提取后，將所得溶液分別過濾于50 mL 容量瓶中，用相應溶劑定容至刻度，搖勻。精密吸取供試品溶液1.0 mL 5 份，分別置于25 mL 比色管中，按2.4.1 標準曲線繪制操作方法顯色后，以相應的溶液為空白對照，在510 nm波長處測定其吸光度，計算提取液中總黃酮的含量，結(jié)果平均總黃酮含量為0.1184 mg/g，RSD 為0.28%(n=5)，表明該方法重現(xiàn)性好。

3.7 穩(wěn)定性實驗

精密吸取2.2 項操作中制備的供試品液1.0 mL 于25 mL 比色管中，按2.4.1 操作方法顯色后，以相應的溶液為空白對照，分別在0、10、20、30、40、50、60 min，在510 nm 波長處測定其吸光度，結(jié)果得RSD=0.302 %(n=7)。說明天花粉總黃酮提取液經(jīng)顯色后在60 min 內(nèi)穩(wěn)定。

4 討論

一般情況下，游離黃酮類化合物難溶于水或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇等有機溶劑中，本試驗分別對甲醇、乙醇和水三種提取溶劑進行考察，發(fā)現(xiàn)甲醇提取天花粉中總黃酮的提取率明顯比乙醇和水的提取率大，故本試驗選擇甲醇作為提取溶劑。通過對索氏提取、回流提取、微波提取和冷浸提取四種提取方法的考察，發(fā)現(xiàn)回流法提取天花粉中總黃酮的的提取率明顯比其他三種方法的提取率大，故本試驗選擇回流法提取。

正交試驗結(jié)果表明，各因素對天花粉總黃酮提取率的影響程度不同，在趨于提取平衡的條件下，其影響的主次順序為提取溫度＞提取時間＞甲醇濃度＞料液比。通過正交試驗結(jié)果以及最優(yōu)參數(shù)的驗證試驗，最佳提取工藝條件為A2B2C2D2(即甲醇體積分數(shù)50%，料液比1∶15，提取溫度70 ℃，提取時間90 min)。在此條件下進行驗證試驗，測得天花粉中總黃酮平均含量為0.1184 mg/g，RSD 為0.28%(n=5)。該方法提取天花粉中的總黃酮準確度高，操作簡單，穩(wěn)定性和重復性好，適合于天花粉中總黃酮的提取和含量測定。

目前，尚未見有關(guān)天花粉中總黃酮的相關(guān)研究報道，本試驗用甲醇回流法從天花粉中提取總黃酮，對提取物進行定性鑒定，并用Al(NO3)3-NaNO2比色法測定測定了總黃酮含量，為天花粉的藥學價值和進一步綜合開發(fā)利用提供參考數(shù)據(jù)，此研究報告具有一定的參考價值。但天花粉中總黃酮的提取影響因素復雜，包括提取溫度、料液比、提取時間、提取劑濃度、提取劑種類、提取方法、提取次數(shù)和粉碎粒度等。該研究僅對前6 個常規(guī)影響因素進行了研究，其他因素的影響效果還有待進一步深入研究。

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