于京平，張永清，林海燕，林 鶯

1濱州醫(yī)學(xué)院，煙臺 264003;2山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355

栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim.為葫蘆科多年生草質(zhì)藤本植物，其干燥成熟果皮是常用中藥瓜蔞皮，可清熱化痰、利氣寬胸，具有抗心律失常、擴(kuò)張冠狀動脈、增加冠脈血流量等藥理作用;臨床常用于治療肺熱咳嗽、痰濁黃稠、胸痹心痛、肺癰等［1］。

有關(guān)瓜蔞皮的活性成分至今不明確，現(xiàn)行《中華人民共和國藥典》僅收載了以對照藥材薄層定性的鑒別方法，控制瓜蔞皮藥材質(zhì)量尚缺乏合理指標(biāo)［1］。以瓜蔞皮為原料研制生產(chǎn)的瓜蔞皮注射液可行氣除滿、開胸除痹，用于治療痰濁阻絡(luò)之冠心病、穩(wěn)定型心絞痛等。我們研究發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤［2］、鳥嘌呤核苷［2］、瓜氨酸是瓜蔞皮注射液中存在的主要成分之一?，F(xiàn)代研究顯示，腺嘌呤、鳥苷、瓜氨酸均具有明顯的藥理活性。腺嘌呤可提高紅細(xì)胞攜氧和放氧能力，與磷酸的結(jié)合物可刺激白細(xì)胞增生，用于防治白細(xì)胞減少癥［3］;鳥苷可改善心腦血液循環(huán)，具有防止心率失常、抗腫瘤、抗病毒等活性［4］。瓜氨酸在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為人體必需氨基酸:L-精氨酸，在維持心血管正常功能的一氧化氮代謝中發(fā)揮著重要作用［5］。因此，在活性成分尚不明確的情況下，可以將腺嘌呤、鳥苷、瓜氨酸作為瓜蔞皮藥材質(zhì)量的控制指標(biāo)。

中藥材采收期對保證中藥材質(zhì)量有重要意義，若采收期適宜，則可保證中藥材中的藥用部分產(chǎn)量和有效成分含量都達(dá)到較高水平。目前，有關(guān)采收時間對瓜蔞皮藥材質(zhì)量的影響等方面的研究幾乎為空白。本文在統(tǒng)一種質(zhì)的前提下，選取腺嘌呤、鳥苷、瓜氨酸等化學(xué)成分作為指標(biāo)，對栝樓果皮不同生長期化學(xué)成分的動態(tài)積累進(jìn)行分析，為確定瓜蔞皮藥材的適宜采收期提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Agilent 1200，美國Agilent);超聲儀(KQ-200，昆山市超聲儀器有限公司);數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9070MBE，上海博訊公司);電子天平(FA1104，上海天平儀器廠)。

1.2 瓜蔞皮藥材

所用材料采自山東中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)張永清教授鑒定，確認(rèn)為葫蘆科栝樓屬植物栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim.。自7月3 日幼果期，在健壯枝條的中段選擇花后發(fā)育天數(shù)相同的栝樓幼果，掛牌標(biāo)記。自7 月3 日幼果期到10 月26 日果實成熟期共采樣11 次，采樣時間統(tǒng)一定在晴朗的上午8∶00 時左右。不同生長期栝樓果皮的采收時間及外觀性狀見表1。

表1 不同生長期栝樓果皮的外觀性狀Table 1 The morphologic characteristics of T.kirilowii peel from different growth periods

1.3 試劑

對照品:腺嘌呤(批號050302，上海伯奧生物科技有限公司)、鳥苷(批號26-2006，上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化中心)，瓜氨酸(批號0875-200205，中國藥品生物制品檢定所)，經(jīng)HPLC-UV 檢測純度均達(dá)98%以上;鄰苯二甲醛(色譜級，阿拉丁試劑上海有限公司);一氯甲酸芴甲酯(色譜級，阿拉丁試劑上海有限公司);乙腈(色譜級，Tedia，美國);甲醇(色譜級，Tedia，美國);純凈水。

2 實驗方法

2.1 核苷類成分的測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱:Waters Atlantis T3(5 μm，4.6 mm×150 mm);流動相:水(A)-甲醇(B);柱溫為室溫;檢測波長:254 nm;進(jìn)樣量:50 μL。流動相梯度洗脫程序:0～15 min，100%A;15～35 min，100%～90%A;35～60 min，90%～70%A。

2.1.2 對照品溶液制備

精密稱取一定量減壓干燥至恒重的鳥苷、腺嘌呤對照品，加15%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至20 mL 容量瓶中，定容，混勻，配制成腺嘌呤濃度為0.0310 mg/mL、鳥苷濃度為0.0704 mg/mL 的對照品溶液;以0.45 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液備用。

2.1.3 樣品溶液制備

將瓜蔞皮置于55 ℃條件下烘干，粉碎，過四號篩。四分法取樣，精密稱定適量干燥粉末，置具塞瓶中，加15%甲醇10 mL，稱重;50 ℃溫浸1 h，50 ℃超聲提取1 h，冷卻，用15%甲醇補(bǔ)足重量，離心10 min(4500 rpm)，取上清液，重復(fù)提取2 次，合并上清液，用0.45 μm 濾膜濾過，即得。

2.1.4 樣品測定

分別精密吸取對照品溶液與樣品溶液50 μL，按上述色譜條件測定其峰面積積分值，以外標(biāo)法計算樣品溶液中的鳥苷、腺嘌呤含量，重復(fù)3 次。

2.1.5 線性關(guān)系考察及標(biāo)準(zhǔn)曲線

制備腺嘌呤、鳥苷對照品系列濃度溶液，分別精密吸取50 μL 進(jìn)樣，按2.1.1 項下色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以對照品實際進(jìn)樣量(mg)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，腺嘌呤Y=8800000X-7.2062(R2=1)，鳥苷Y=3500000X +6.8633(R2=1)，見圖1。

圖1 對照品(1)與供試液(2)的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of the reference substance (1)and sample (2)

2.2 瓜氨酸的測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent TC-C18柱(4.6 mm×250.0 mm，5 μm);流動相:取醋酸鈉10.88 g，加水4000 mL 使溶解，加三乙胺0.8 mL，四氫呋喃24 mL，混勻，用2%冰醋酸溶液調(diào)節(jié)pH 值至7.20，即得流動相A;取醋酸鈉10.88 g，加水800 mL 使溶解，用2%冰醋酸溶液調(diào)節(jié)pH 值至7.20，加乙腈1400 mL，甲醇1800 mL，混勻，即得流動相B。柱溫:25 ℃;檢測波長:338 nm;進(jìn)樣量:50 μL?？焖僦把苌磻?yīng):供試品和對照品溶液在pH10.2 的硼酸緩沖液中首先和1%鄰苯二甲醛(OPA)反應(yīng)，再用0.5%一氯甲酸芴甲酯(FMOC)溶液進(jìn)行衍生。

表2 流動相梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

2.2.2 對照品溶液制備

精密稱取一定量減壓干燥至恒重的瓜氨酸對照品，加水溶解，轉(zhuǎn)移至20 mL 容量瓶中定容，混勻，配制成濃度為0.368 mg/mL 對照品溶液;以0.45 μm濾膜濾過，即得。

2.2.3 樣品溶液制備

精密稱定適量干燥粉末，置具塞瓶中，加水10 mL，稱重;50 ℃溫浸1 h，50 ℃超聲提取1 h，冷卻，用水補(bǔ)足重量，離心10 min(4500 rpm)，取上清液，重復(fù)提取2 次，合并上清液，用0.45 μm 濾膜濾過，即得。

2.2.4 樣品測定

分別精密吸取對照品溶液與樣品溶液50 μL，按上述色譜條件測定其峰面積積分值，以外標(biāo)法計算樣品溶液中的瓜氨酸含量，重復(fù)3 次。

2.2.5 線性關(guān)系考察及標(biāo)準(zhǔn)曲線

制備瓜氨酸對照品系列濃度溶液，分別精密吸取50 μL 進(jìn)樣，按2.2.1 項下色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以對照品實際進(jìn)樣量(mg)為橫坐標(biāo)(X)，繪制瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=2000000X-1.3675(R2=1)，見圖2。

2.3.1 精密度試驗

精密吸取對照品溶液，按2.1.1、2.2.1 項下色譜條件，測定腺嘌呤、鳥苷、瓜氨酸峰面積，重復(fù)5

圖2 對照品(1)與供試液(2)的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of the reference substance (1)and sample (2)

2.3 方法學(xué)考察次，其峰面積RSD 分別為1.17%、

2.3.2 穩(wěn)定性試驗

精密吸取樣品溶液，在10 h 內(nèi)測定腺嘌呤、鳥苷、瓜氨酸峰面積5 次，其峰面積RSD 值分別為2.12%、1.12%、1.00%，表明樣品溶液在10 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗

精密稱取藥材粉末，分別按照2.1.3、2.2.3 項下方法同時制備5 份，分別測定腺嘌呤、鳥苷、瓜氨酸含量，其RSD 均小于5%，表明重復(fù)性良好。

2.3.4 加樣回收率試驗

精密稱量已知鳥苷、腺嘌呤、瓜氨酸含量的樣品1.000 g，共6 份，分別加入一定量的對照品，分別按照2.1.3、2.2.3 項下方法制備，按2.1.1、2.2.1 項下色譜條件測定鳥苷、腺嘌呤、瓜氨酸含量，按回收率=(C-A)/B ×100%(A 為樣品中所含被測成分量;B 為加入對照品量;C 為實測值)計算回收率，結(jié)果鳥苷、腺嘌呤、瓜氨酸對照品回收率均值分別為101.20%、100.67%、100.15%，其RSD 分別為1.63%、1.91%，1.70%，表明鳥苷、腺嘌呤、瓜氨酸對照品回收率符合要求。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同生長期栝樓果皮鳥苷、腺嘌呤含量的測定及比較

對栝樓果皮生長發(fā)育過程中鳥苷、腺嘌呤含量進(jìn)行動態(tài)測量，變化情況動態(tài)如圖3。

由圖3 可以看出，生長發(fā)育前期腺嘌呤、鳥嘌呤核苷含量總體呈下降趨勢，9 月中旬果實體積、重量基本達(dá)到最大時，兩者含量達(dá)到最低點;之后腺嘌呤、鳥苷快速積累，至果皮表面顏色稍微泛黃時，腺嘌呤含量達(dá)到最高值0.1893 mg/g，至果皮表面顏色基本全黃、僅維管束凸起處為綠色時鳥苷含量達(dá)到最高值0.4128 mg/g;隨著果實進(jìn)一步成熟，兩者含量均出現(xiàn)下降，表現(xiàn)出隨著果實成熟度增加而下降的變化趨勢。

圖3 不同生長期栝樓果皮腺嘌呤、鳥苷含量的變化Fig.3 The contents of adenine and guanine nucleoside in T.kirilowii peel from different growth periods

圖4 不同生長期栝樓果皮瓜氨酸含量的變化Fig.4 The contents of citrulline in T.kirilowii peel from different growth periods

3.2 不同生長期栝樓果皮瓜氨酸含量的測定及比較

對栝樓果皮生長發(fā)育過程中瓜氨酸含量進(jìn)行動態(tài)測量，變化情況動態(tài)如圖4。

由圖4 可以看出，瓜氨酸含量短暫升高之后平穩(wěn)降低，8 月17 日達(dá)到最低僅為0.4492 mg/g，之后呈現(xiàn)逐漸升高，至果皮顏色基本為黃色僅維管束凸起部分為綠色，此時瓜氨酸含量達(dá)到最高值12.8834 mg/g，隨著果實進(jìn)一步成熟至果皮表面顏色基本全黃含量下降，至栝樓果實完全成熟果皮表面皺縮時含量稍微上升。

4 討論與小結(jié)

4.1 栝樓果實生長動態(tài)

栝樓果實從形成到成熟呈現(xiàn)出生長動態(tài)規(guī)律變化，經(jīng)歷果實重量、果實體積、果實長、果實直徑的增大、果實變軟、果皮顏色變化等一系列變化。9 月26日果皮顏色稍微泛黃標(biāo)志著栝樓果實進(jìn)入轉(zhuǎn)色期。

4.2 栝樓果皮生長過程中化學(xué)物質(zhì)積累動態(tài)

我們系統(tǒng)研究栝樓果皮整個生長周期多種化學(xué)成分含量變化規(guī)律，進(jìn)一步探討栝樓果皮化學(xué)物質(zhì)積累與生長發(fā)育的關(guān)系。果皮中腺嘌呤含量在果皮顏色微黃時達(dá)到最高;鳥苷、瓜氨酸含量在果皮顏色基本全黃僅維管束凸起處為綠色時達(dá)到最高;總的來說未完全成熟的栝樓果皮中的化學(xué)物質(zhì)含量高于完全成熟的栝樓果皮，多種化學(xué)成分含量變化與果皮顏色轉(zhuǎn)變密切相關(guān)。

4.3 采收期的確定

采收是藥材生產(chǎn)過程中的重要環(huán)節(jié)，直接影響著瓜蔞皮藥材的質(zhì)量與產(chǎn)量，中藥材的采收應(yīng)綜合考慮有效成分含量和產(chǎn)量的動態(tài)變化，最大限度保證中藥材中的藥用部分產(chǎn)量和有效成分含量均達(dá)到較高水平。針對栝樓果皮采收期沒有明確記載，傳統(tǒng)采收期多以栝樓果實為目標(biāo)產(chǎn)物。栝樓果皮采收期與有效成分的動態(tài)累積有何內(nèi)在關(guān)聯(lián)，亦未見系統(tǒng)研究報道。結(jié)合實驗結(jié)果我們認(rèn)為果皮顏色未轉(zhuǎn)黃之前是栝樓果皮生長和積累的重要時期，不宜采收;栝樓果皮應(yīng)于10 月初果實尚未完全成熟時、果皮表面顏色基本為黃色僅維管束凸起處為綠色時采摘，此階段栝樓果皮多種化學(xué)成分含量均達(dá)到最高峰;不宜過遲，否則果實老熟，皮薄，產(chǎn)量質(zhì)量均下降。

不同采收時間瓜蔞皮藥材質(zhì)量有明顯差異，獲得高產(chǎn)質(zhì)優(yōu)的瓜蔞皮藥材，需要精確到距離開花后的具體天數(shù)，之前提到由于其開花結(jié)果時間不一致，精確開花后的具體天數(shù)實踐操作復(fù)雜;但通過果皮顏色變化藥農(nóng)就可以準(zhǔn)確快速判斷最佳采收時間，獲得高產(chǎn)質(zhì)優(yōu)的瓜蔞皮藥材，生產(chǎn)上直觀性強(qiáng)。另外在采收時我們可以做到分批選擇性采收，有效降低采收難度。

綜上所述，栝樓為多年生藤本植物開花掛果持續(xù)時間長，目前栝樓果皮發(fā)育過程中化學(xué)物質(zhì)積累規(guī)律等方面的研究尚為空白。栝樓果皮在發(fā)育和成熟過程中發(fā)生了很多結(jié)構(gòu)和代謝上的變化，我們通過了解各種化學(xué)物質(zhì)在栝樓果皮生長發(fā)育過程中的積累規(guī)律，探索栝樓果皮品質(zhì)的形成規(guī)律，提示我們通過制定合理的栽培措施調(diào)控其化學(xué)物質(zhì)含量具有可行性。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission (國家藥典委員會).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (中華人民共和國藥典).Beijing:China Medical Science Press，2010.Vol I，52.

2 Teng YR(滕勇榮).Studies on chemical constituents of Trichosanthes kirilowii Marim.and Trichosanthes skin injection.Jinan:Shandong University of Chinese Medicine(山東中醫(yī)藥大學(xué))，MSc.2011.

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4 Kinahan JJ，KowaL EP，Grindey GB.Biochemical and antitumor effects of the combination of thymidine and 1-β-D-arabinofuranosylcytosine against leukemia L1210.Cancer Res，1981，41:445-451.

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