鄭明奮 張學(xué)輝 鄒苑斌 張沈華 黃杰波

(廣東省第二人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，廣東廣州510317)

鼻咽癌是來(lái)源于鼻咽黏膜上皮細(xì)胞的鱗狀細(xì)胞癌惡性腫瘤。在中國(guó)廣東、廣西等地區(qū)鼻咽癌的發(fā)病率很高，且其5年生存率不高于70%［1］。鼻咽癌是一種與多種因素相關(guān)的疾病［2］，遺傳和表觀遺傳修飾在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用［3］。EB病毒感染、吸煙、喝酒都與鼻咽癌的發(fā)生有著密切的聯(lián)系［4］。盡管局部放療能在一定程度上抑制鼻咽癌的發(fā)展，但仍有約30%～40%的患者在4年內(nèi)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［2］。因此，了解其發(fā)病機(jī)制對(duì)于防治鼻咽癌具有重要意義。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，microRNA的調(diào)節(jié)異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。microRNA是內(nèi)源性的單鏈非編碼微分子RNA，普遍存在動(dòng)植物體內(nèi)，長(zhǎng)度一般約為22個(gè)核苷酸［5］。然而，microRNA在鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制研究中尚未闡明［6，7］。let－7 是最早發(fā)現(xiàn)的一種 microRNA，研究表明let－7家族在多數(shù)腫瘤內(nèi)呈低表達(dá)［8］，并且發(fā)現(xiàn) let－7可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，轉(zhuǎn)移，侵襲，并與預(yù)后相關(guān)［9］，因此推測(cè)其可能成為潛在的治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)記物。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染let－7模擬物，增加細(xì)胞內(nèi)let－7的表達(dá)研究let－7對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期以及鼻咽癌細(xì)胞遷移的影響，進(jìn)一步探索let－7抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖的可能機(jī)制。本研究為臨床治療鼻咽癌的新靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)，也為其他腫瘤基因治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 正常人鼻咽部永生化上皮細(xì)胞NP69，人鼻咽癌 CNE－1和 CNE－2細(xì)胞，購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。

1.1.2 主要試劑 let－7 microRNA模擬物及對(duì)照的microRNA購(gòu)于美國(guó)Dharmacon公司;RPMI1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;胎牛血清:浙江四季青公司;Keratinocyte－SFM 培養(yǎng)基，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑和 Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自美國(guó) Sigma公司;PrimeScriptTMRT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR?Premix Ex TaqTM實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)自TakaRa;細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶 (cyclindependent kinase，CDK)6，c－myc 兔抗人單克隆抗體購(gòu)于美國(guó) Cell Signaling Technology;Anti－β－actin 抗體和Anti－rabbit HRP酶標(biāo)IgG抗體購(gòu)于美國(guó)Sigma－Aldrich;細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)平板購(gòu)自美國(guó)Corning;RIPA裂解液購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司。細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 正常人鼻咽部永生化細(xì)胞NP69接種于含10%胎牛血清的新鮮Keratinocyte－SFM培養(yǎng)基中，CNE－1和CNE－2細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的新鮮RPM I1640培養(yǎng)基中，含100 U/L青霉素，100 mg/L鏈霉素，置于37℃、飽和濕度，5%CO2的培養(yǎng)箱中。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及合成 let－7 microRNA及內(nèi)參U6引物由大連寶生物公司設(shè)計(jì)并合成，其中l(wèi)et－7的引物序列為:5′－ TGAGGTAGGAGGTTGTATAGTT－3′，內(nèi)參 U6的引物序列為:5′－CTCGCTTCGGCAGCACA－3′。

1.2.3 let－7在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá) 提取正常鼻咽部永生化上皮細(xì)胞NP69，鼻咽癌細(xì)胞CNE－1和CNE－2總RNA并逆轉(zhuǎn)錄，用熒光定量PCR的方法檢測(cè)這些細(xì)胞中 let－7 的表達(dá)。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和熒光定量RT－PCR 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化、重懸鋪6孔板，4×105/孔。實(shí)驗(yàn)設(shè)置let－7模擬物組，陰性對(duì)照(對(duì)照microRNA)組及空白對(duì)照3組。其中空白對(duì)照組只轉(zhuǎn)染Lipofectamine2000，陰性對(duì)照組為 對(duì)照 microRNA+Lipofectamine2000，let－7 組為 let－7+Lipofectamine2000，按照 Lipofectamine2000使用說(shuō)明轉(zhuǎn)染。設(shè)置5個(gè)不同濃度梯度組，分別為10、20、50、80、100 nmol/L組，使用熒光顯微鏡觀測(cè)轉(zhuǎn)染羧基熒光素(FAM)標(biāo)記的目的 microRNA，確定其轉(zhuǎn)染效率。用熒光定量 RT－PCR 進(jìn)一步驗(yàn)證let－7在CNE－2細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣品3個(gè)復(fù)孔;PCR兩步法條件:95℃ 10 s預(yù) 變 性 ;然 后 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循，各樣品采用U6作為內(nèi)參，let－7相對(duì)表達(dá)量采用2－CT方法計(jì)算。

1.2.5 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化、重懸以 1×104/孔鋪24孔板，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，棄去每孔培養(yǎng)液。加入含let－7(50 nmol/L)和NC microRNA 的新鮮培養(yǎng)液，另設(shè)置只加Lipofectamine2000的陰性對(duì)照組和不加細(xì)胞只加培養(yǎng)基的空白對(duì)照組。常規(guī)培養(yǎng)，于24、48、72和96 h用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，每組3孔，取平均值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化、重懸按每孔100μL種于96孔板，每孔含1×103細(xì)胞，設(shè)7個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，棄去每孔培養(yǎng)液。加入含let－7(50 nmol/L)和NC microRNA的新鮮培養(yǎng)液，另設(shè)置只加Lipofectamine2000的陰性對(duì)照組和不加細(xì)胞只加培養(yǎng)基的空白對(duì)照組。加藥后分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h 和96 h，每孔加入15 μL MTT，4 h 后吸棄孔中液體，每孔加入100μL二甲基亞砜溶液，振蕩10 min，酶標(biāo)儀570 nm測(cè)A值，取平均值繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 CNE－2細(xì)胞，將細(xì)胞按 5×105/孔分別接種至 6孔板內(nèi)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)至融合度達(dá)到100%形成單層細(xì)胞后，用10μL無(wú)菌槍頭沿孔底呈“一”字形劃痕，PBS輕柔洗滌，加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，應(yīng)用Image J軟件觀察并測(cè)量劃痕0、48 h后細(xì)胞向致傷區(qū)遷移的距離，計(jì)算不同視野中10處劃痕寬度，取其均值，根據(jù)原始細(xì)胞致傷區(qū)距離計(jì)算出細(xì)胞相對(duì)遷移率。胞遷移率(%)=(原劃痕寬度－現(xiàn)劃痕寬度)/原劃痕寬度 ×100% 。

1.2.8 細(xì)胞周期檢測(cè) 細(xì)胞收集后以冰PBS洗滌，75%冰乙醇振蕩混勻，4℃固定過(guò)夜，洗滌離心后PBS重懸細(xì)胞，加RNA水解酶37%30 min，之后碘化丙啶室溫避光染色30 min，流式細(xì)胞儀行細(xì)胞周期檢測(cè)，重復(fù)3次。

(1)調(diào)節(jié)閥分為手動(dòng)調(diào)節(jié)閥和電動(dòng)調(diào)節(jié)閥兩種。電動(dòng)調(diào)節(jié)閥一般是由電氣儀表專業(yè)根據(jù)設(shè)計(jì)參數(shù)進(jìn)行選型。冷、熱源系統(tǒng)中安裝手動(dòng)調(diào)節(jié)閥的位置一般在：①分水器的各個(gè)分支管上，對(duì)各支路流量進(jìn)行調(diào)節(jié)；②換熱器一次水的回水管上，調(diào)節(jié)換熱器的供熱量。手動(dòng)調(diào)節(jié)閥要選擇閥門(mén)開(kāi)度和流量基本為等百分比型的，要根據(jù)管道的最大流量值確定調(diào)節(jié)閥的口徑，一般情況下閥的口徑要小于所安裝管道的管徑。

1.2.9 細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控因子檢測(cè) 收集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組 3組細(xì)胞，Trizol提取細(xì)胞總 RNA，按PScript@One Step RT－PCR Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，SYBRTMPremix Ex TaqⅢ進(jìn)行熒光定量 RT－PCR檢測(cè)。細(xì)胞周期調(diào)控因子引物見(jiàn)表1。反應(yīng)條件:95℃ 30 s熱啟動(dòng);95℃ 5 s變性，60℃ 34 s退火延伸，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.10 Western blotting檢測(cè)c－myc和CDK6的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的CNE－2細(xì)胞，以4×105個(gè)細(xì)胞每孔接種于 6孔板中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 let－7(50 nmol/L)和對(duì)照microRNA 72h后去除培養(yǎng)基，PBS洗3遍，RIPA裂解液裂解細(xì)胞后，12 000 g 4℃離心5 min，收集上清于－20℃保存。取16μL上述收集的蛋白上清，加入4μL SDS－上樣緩沖液，于沸水中變性處理5 min后，等量上樣于分離膠濃度10%、濃縮膠濃度5%的聚丙烯酰胺凝膠中電泳(SDS－PAGE電泳)，電泳完畢后，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，于常溫下在脫脂奶粉濃度5%的TBST中封閉 1 h，然后分別加入 Anti－c－myc和 CDK6 抗體(1∶1 000)及 Anti－β－actin 抗體 (1∶3 000)4 ℃過(guò)夜，用TBST洗膜4遍后加入2抗Anti－rabbit IgG(1∶10 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜后加入發(fā)光液1 mL，暗室中用感光膠片記錄蛋白條帶結(jié)果。

表1 熒光定量RT-PCR引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以ˉx±s表示，采用One－Way ANOVO統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，P＜0.05認(rèn)為結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 let－7家族在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)

用熒光定量PCR的方法檢測(cè)let－7家族在鼻咽癌細(xì)胞CNE－2和CNE－1中的表達(dá)。結(jié)果顯示，與正常鼻咽部上皮細(xì)胞NP69相比，CNE－2和CNE－細(xì)胞中 let－7 f家族 (let－7a，－7b，－7c，－7d，－7e，－7g，和 －7i)的表達(dá)顯著降低(圖 1)，P＜0.05。

圖1 let-7家族在鼻咽癌細(xì)胞(CNE-2和CNE-1)中的表達(dá)顯著降低

2.2 let－7瞬時(shí)轉(zhuǎn)染檢測(cè)結(jié)果

分別使用5個(gè)濃度梯度組轉(zhuǎn)染FAM標(biāo)記的let－7，48 h后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示:50 nmol/L組的FAM標(biāo)記 let－7轉(zhuǎn)染效率最高，可高達(dá)90% 左右(圖2)，因此在后續(xù)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中l(wèi)et－7濃度均選用50 nmol/L。采用熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染let－7模擬物組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組CNE－2 細(xì) 胞中的 let－7 相對(duì)含量，結(jié)果表明:let－7 的表達(dá)與對(duì)照組相比，隨著轉(zhuǎn)染濃度的增加而升高，在50 nmol/L處達(dá)到最高(圖3)。

圖2 CNE-2轉(zhuǎn)染let-7(50 nmol/L濃度)模擬物48 h后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率(×200)

2.3 let－7 對(duì) CNE－2 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用

2.3.1 細(xì)胞計(jì)數(shù) 轉(zhuǎn)染了let－7的實(shí)驗(yàn)組與轉(zhuǎn)染了對(duì)照microRNA和空白對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了let－7的CNE－2細(xì)胞從轉(zhuǎn)染后第3天起細(xì)胞增殖明顯受抑(圖4A)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖3 熒光定量PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染let-7后let-7 microRNA的表達(dá)

2.3.2 細(xì)胞增殖率的檢測(cè) MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率來(lái)觀察let－7對(duì) CNE－2細(xì)胞的增殖抑制作用。結(jié)果表明，在第1、2天3組細(xì)胞的A值經(jīng)單因素方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而在第3天、第4天3組細(xì)胞的A值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖 4B)。

圖4 let-7對(duì)CNE-2增殖的抑制作用

2.4 let－7 對(duì) CNE－2 細(xì)胞遷移的影響

劃痕48h后，轉(zhuǎn)染let－7組的遷移率為 (0.56±0.01)，轉(zhuǎn)染了NC microRNA的陰性對(duì)照組為(0.85±0.02)，空白對(duì)照組遷移率為 (0.83±0.03)，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組和陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染let－7后明顯抑制鼻咽癌CNE－2細(xì)胞的遷移能力，見(jiàn)圖 5－6。

圖5 let-7對(duì)CNE-2遷移的抑制作用

圖6 let-7對(duì)CNE-2遷移的抑制比較

2.5 let－7 對(duì) CNE－2 細(xì)胞周期的影響

let－7可顯著影響鼻咽癌細(xì)胞周期分布(圖7)，使G0－G1期比例由68.23%±2.03%升高到82.90%±1.98%，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，S期比例由22.07%±1.14%降低到5.80%±0.87%(P＜0.05)，G2－M期比例由8.86%±1.10%升高到11.46%±1.60%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)圖 7－8。

圖7 let-7對(duì)細(xì)胞周期的影響

2.6 let－7對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控因子的影響

應(yīng)用熒光定量PCR法檢測(cè)3組細(xì)胞的多種細(xì)胞周期調(diào)控因子的表達(dá)水平，結(jié)果顯示高表達(dá)let－7后CDK6及 c－myc的 mRNA表達(dá)水平分別下降61.89%和58.21%，其他因子的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖9)。對(duì) CDK6及 c－myc行免疫印跡法檢測(cè)，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)let－7后CDK6及c－myc的表達(dá)亦下調(diào)(圖10)。

圖8 let-7對(duì)細(xì)胞周期的影響比較

圖9 let-7對(duì)CNE-2細(xì)胞周期調(diào)控因子的影響

圖10 Western blotting檢測(cè)過(guò)表達(dá)let-7后c-myc和CDK 6蛋白水平的表達(dá)及比較

3 討論

microRNA的表達(dá)調(diào)控異常與多種腫瘤相關(guān)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。microRNA參與腫瘤細(xì)胞的許多生物學(xué)活動(dòng)，如細(xì)胞增殖，分化和凋亡等［10－15］，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期和末端分化異常。因此，以microRNA為切入點(diǎn)，展開(kāi)腫瘤相關(guān)microRNA的調(diào)控機(jī)理研究，對(duì)闡明腫瘤發(fā)生機(jī)制及腫瘤治療具有重要意義。let－7是最早發(fā)現(xiàn)的一種microRNA，人 let－7 家族有 13 個(gè)成員，包括 let－7a 1、7a－2、7a－3、7b、7c、7d、7e、7f－l、7f－2、7g、7i、miR－98和 miR－202［16］。let－7 家族是一種抑癌 microRNA，在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)［17－18］，并且 let－7 家族可以作為腫瘤預(yù)后的標(biāo)記物，因?yàn)閘et－7家族的低表達(dá)與腫瘤預(yù)后不良相關(guān)，已有研究表明，低 let－7表達(dá)與肺癌預(yù)后不良相關(guān)［19］。

let－7已被公認(rèn)為在肺癌發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，在143例肺癌患者中，44%患者癌組織中l(wèi)et－7家族的表達(dá)水平顯著低于其在患者癌旁組織中的表達(dá)［20］;microRNA 芯片結(jié)果提示，let－7家族的表達(dá)水平在肺癌組織中表現(xiàn)出特異性降低，而且let－7表達(dá)水平低的患者術(shù)后存期較短，預(yù)后較差［20－21］，但恢復(fù)其正常表達(dá)有顯著的腫瘤抑制作用［22－25］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，let－7d 在鼻咽癌患者上皮細(xì)胞中表達(dá)顯著降低，且與預(yù)后不良相關(guān)［26］。但let－7在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚未闡明。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染 let－7模擬物使 let－7 在 CNE－2細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著升高，并通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過(guò)表達(dá)let－7后鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，增殖活性明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞周期結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá) let－7后，G0－G1期細(xì)胞顯著升高，而 S期細(xì)胞顯著下降，并且過(guò)表達(dá)let－7可顯著抑制細(xì)胞的遷移能力。

有研究表明，let－7 是通過(guò)抑制 c－myc，RAS，CDK6及CyclinD2的的表達(dá)發(fā)揮其抑癌作用的。let－7的靶基因包括Ras家族、高遷移率組 A蛋 白、c－myc和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子(細(xì)胞分裂周期基因25A、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6、細(xì)胞周期蛋白D2)［23，25，27］。其中最典型的兩個(gè)是促進(jìn)細(xì)胞增殖的Ras家族和參與細(xì)胞增殖分化的高遷移率組A蛋白。let－7可以抑制多種腫瘤中 c－myc的表達(dá)，例如結(jié)腸癌［28］。

為進(jìn)一步探討let－7抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制，我們檢測(cè)了細(xì)胞周期中G1－S調(diào)控點(diǎn)上的相關(guān)細(xì)胞周期蛋白(CCND1、CCND2、CCND3，CCNE1，CCNE2)，細(xì)胞周期依賴性激酶(CDK2，CDK4，CDK6)，以及p14，p16，p21，p53，c－myc 以及 pRb 等基因的表達(dá)。熒光定量PCR結(jié)果提示，過(guò)表達(dá)let－7后，CDK6和c－myc的表達(dá)均顯著性下降，蛋白免疫印跡法的結(jié)果與熒光定量PCR的結(jié)果一致。研究結(jié)果表明，let－7可能通過(guò)抑制CDK6和c－myc的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞增殖，本研究的結(jié)果與let－7在其他腫瘤中的生物學(xué)作用以及作用機(jī)制相一致。本研究為基因治療鼻咽癌提供了靶標(biāo)，使基因治療鼻咽癌成為可能。并且本研究為深入探索let－7在鼻咽癌中的作用及作用機(jī)制提供了可靠的依據(jù)，也為其他惡性腫瘤的基因治療提供參考。

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