李偉群 柳國勝 韓莎莎 宋莉莉 強瑞雪

(廣州開發(fā)區(qū)醫(yī)院兒科，廣東廣州510730)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指妊娠后才發(fā)生或首次發(fā)現(xiàn)的糖尿病［1］。其不僅對母親的身體有危害，而且對胎兒也有許多不良的影響，尤其是與心臟發(fā)育異常密切相關(guān)［2］，且即便其血糖糾正后，其致心臟發(fā)育異常的影響依然存在［3］。目前為止，妊娠期糖尿病如何導(dǎo)致胎兒先天性心臟病的機制還不明確。Nkx2.5是所有脊椎動物心臟發(fā)生中最早表達的轉(zhuǎn)錄因子，也是心臟前體細胞最早的標志物。有報道認為Nkx2.5參與了妊娠期糖尿病母親所生先天性心臟病患兒的發(fā)病過程［4］。因此本研究通過藥物誘導(dǎo)建立妊娠期糖尿病大鼠模型，采用免疫組織化學(xué)和實時熒光定量PCR檢測妊娠期糖尿病胎鼠心臟Nkx2.5蛋白和mRNA的表達，以此了解其是否參與了妊娠期糖尿病胎鼠心臟發(fā)育異常的發(fā)病過程，從而為闡述妊娠期糖尿病胎鼠心臟發(fā)育異常機制提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 材料

健康成年雌性SD大鼠(體質(zhì)量230～290 g)80只，購于廣東省實驗動物中心。STZ(美國Sigma公司)，血糖檢測用美國強生公司生產(chǎn)的卓越型血糖儀和試紙。光學(xué)顯微鏡及成像系統(tǒng)(日本Olympas光學(xué)工業(yè)株式會社)。兔抗大鼠Nkx2.5多克隆抗體購自美國Bioworld Technology公司。S－P免疫組化染色試劑盒購自福建邁新生物技術(shù)有限公司。實時熒光定量 PCR用的 SYBR?Premix Ex TaqTM購自Invitrogen公司。定量PCR儀:美國BIO－RAD熒光定量PCR儀CFX96。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模 80只SD雌鼠按數(shù)字表隨機分為對照組及實驗組(GDM組)，各40只。將各組雌鼠按照雄雌比例為1∶3分別與成年雄鼠合籠過夜，次晨取陰道分泌物涂在玻片上鏡檢，發(fā)現(xiàn)精子者記為妊娠第0天，標記孕鼠計算孕期，并隔離喂養(yǎng)。本妊娠期糖尿病大鼠的動物模型是參照國內(nèi)文獻(柳國勝等［5］)報道的實驗?zāi)Ｐ头椒ń⒌?。GDM組腹腔注射STZ 40 mg/kg(溶于現(xiàn)配的0.1 mol/L，pH 4.4的檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液)，對照組注射等量的檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液。72 h后經(jīng)尾靜脈采血測血糖，血糖≥8.12 mmol/L者，納入實驗組。意外死亡和建模失敗者共有4只，對照組40只，血糖正常。各組于孕12、孕15、孕19 d隨機分組分批剖宮，取胎鼠心臟組織，置于4%甲醛溶液中固定后，脫水，石蠟包埋，常規(guī)切片，供免疫組化分析，HE染色。

1.2.2 免疫組化測定 切片脫蠟后，置入0.01 mmol/L檸檬酸鈉抗原修復(fù)液中進行組織抗原修復(fù)。加過氧化酶阻斷劑阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，加兔抗鼠Nkx2.5抗體，蘇木素復(fù)染，脫水后中性樹膠封片，顯微鏡拍照，圖像分析。

1.2.3 mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR法，以β－actin為內(nèi)參照，檢測胎鼠心臟組織中 Nkx2.5 mRNA的表達。Trizol法提取胎鼠心臟組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取2μL進行PCR反應(yīng)。內(nèi)參片段為 β－actin，片段長度 200bp;目的片段為 Nkx2.5，片段 長 度 176bp。 設(shè) 計 的 引 物:Nkx2.5－F1:5′－GCCAACAGCAACTTCGTGA－3′;Nkx2.5－R1:5′－GAGTCATCGCCCTTCTCCTA－3′。預(yù)變性，變性，退火，延伸，共40個循環(huán)，熔解曲線分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理相關(guān)數(shù)據(jù)。計量資料數(shù)值以ˉx±s表示，組內(nèi)差別用單因素方差分析，組間差別比較采用LSD－t檢驗，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組雌鼠喂養(yǎng)期間體重及血糖變化情況

建模初SD母鼠數(shù)量為80只，GDM組意外死亡和建模失敗者共有4只，符合條件者實為76只。給藥后第3天GDM組母鼠血糖明顯高于對照組母鼠血糖，P＜0.01。GDM組母鼠體質(zhì)量與對照組相比，兩組體質(zhì)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01，見表1。

表1 母鼠血糖、體重情況比較(±s)

表1 母鼠血糖、體重情況比較(±s)

注:與同一時間點對照組比較，*P＜0.01。

組別(n) 血糖(mmol/L) 體質(zhì)量(g)GDM 組 12 d(36) 13.94±0.66* 310.6±6.8*GDM 組 15 d(25) 13.54±0.55* 322.2±5.9*GDM 組 19 d(13) 12.70±0.39* 344.8±5.4*對照組 12 d(40) 3.83±0.53 319.8±5.6對照組 15 d(24) 3.85±0.66 333.4±6.5對照組 19 d(11) 3.71±0.37 362.3±4.5

2.2 胎鼠心臟發(fā)育總體情況觀察

GDM組母鼠各孕齡胚胎均出現(xiàn)不同程度的心臟畸形，畸形表現(xiàn)為左心室流出道梗阻、動脈單干、室間隔缺損、室間隔裂、心肌壁肥厚及心腔擴大等。對照組母鼠僅在孕19 d發(fā)現(xiàn)1例心肌肥厚。GDM組母鼠胚胎心臟畸形率顯著高于對照組母鼠(χ2=14.75，P＜0.01)，見表 2。

表2 胎鼠心臟畸形例數(shù)比較(n)

2.3 Nkx2.5蛋白在胎鼠心肌組織的表達

IPP 6.0圖像彩色分析系統(tǒng)陽性細胞計數(shù)顯示，高倍鏡下(400×)陽性細胞表現(xiàn)為細胞核呈黃色或棕褐色，每一切片隨機取3個視野，平均值作為Nkx2.5蛋白表達的平均灰度值:對照組及GDM組Nkx2.5蛋白的表達均隨胎齡的增長而呈上升趨勢，GDM組Nkx2.5蛋白的表達孕12 d至孕15 d上升幅度較大，見圖1。對照組孕19 d較孕12 d或孕15 d表達明顯升高，GDM組孕15 d或孕19 d較孕12 d明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05(見圖2)。而在同一孕期，GDM組Nkx2.5蛋白的表達強度相對對照組顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05(見圖3)。

圖1 胎鼠心臟組織中Nkx2.5表達情況(DAB染色，×200)

圖2 兩組胎鼠組內(nèi)心肌組織Nkx2.5蛋白免疫組化半定量比較

圖3 兩組胎鼠組間心肌組織Nkx2.5蛋白免疫組化半定量比較

2.4 Nkx2.5mRNA在胎鼠心肌組織的表達

GDM組與對照組中Nkx2.5mRNA在胎鼠心肌組織的表達均隨孕期的延長呈增長的趨勢。其中孕12 d及孕19 d GDM組Nkx2.5mRNA較對照組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。孕 15 d GDM組Nkx2.5mRNA與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖 5。

圖4 Nkx2.5的擴增曲線和熔解曲線

圖5 β-actin的擴增曲線和熔解曲線

圖6 各組胎鼠心臟組織Nkx2.5mRNA表達情況比較

3 討 論

妊娠期糖尿病是妊娠期一種常見而嚴重的并發(fā)癥，其可引起自然流產(chǎn)、死產(chǎn)、巨大兒、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩及先天發(fā)育畸形等。但其造成胎兒發(fā)育異常的機制尚未明確。高血糖可造成孕婦體內(nèi)各種氧化物及代謝異常，胎兒發(fā)育過程中所需的某些轉(zhuǎn)錄因子或關(guān)鍵物質(zhì)在此環(huán)境中發(fā)生質(zhì)或量的改變，從而導(dǎo)致胎兒發(fā)育畸形。具體機制還未明確。最近伊朗學(xué)者Tabib［6］研究發(fā)現(xiàn)妊娠期糖尿病母親所生胎兒，先天性心臟病的發(fā)病率高達8.8%，約是正常母親胎兒的8倍。本實驗GDM組各孕齡階段均發(fā)現(xiàn)了不同程度的心臟畸形，其發(fā)生率達15.73%，遠遠高于對照組。

Nkx2.5是心臟同源域蛋白，它是最早發(fā)現(xiàn)的脊椎動物心臟發(fā)育的標志物，在心肌分化前即表達在心臟原始干細胞中，并持續(xù)到成年。它在心臟特異性基因表達方面有著重要的地位，也是心臟分化過程中不可缺少的，其參與了心臟發(fā)育形成及生后正常功能的維持。Nkx2.5突變或缺失可引起人類先天性心臟發(fā)育異常，包括房間隔缺損、室間隔缺損、法樂氏四聯(lián)癥、肺動脈閉鎖、二尖瓣發(fā)育異常及心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)異常［7－8］。

本實驗免疫組化結(jié)果顯示，在孕12 d、孕15 d、孕19 d時，GDM組及對照組胎鼠心臟中均能檢測到Nkx2.5的表達，且隨著孕期的增長，其蛋白在兩組中的表達量均呈上升的趨勢，且表達的部位與唐娟等［9］對正常小鼠心臟發(fā)育過程中Nkx2.5的表達情況的研究相類似。表明在糖尿病胎鼠的心臟組織中Nkx2.5的表達亦呈現(xiàn)一個動態(tài)變化的過程。

本實驗觀察到實驗組Nkx2.5蛋白及其mRNA的表達在孕12 d較對照組明顯減少。對于小鼠來說，孕12 d是小鼠胚胎發(fā)育的早期，此時也是胎鼠心臟發(fā)育的關(guān)鍵時期，母鼠體內(nèi)高血糖能通過胎盤進入胎鼠體內(nèi)，造成胎鼠體內(nèi)同樣表現(xiàn)高血糖。此時的高糖狀態(tài)可能改變了胎鼠體內(nèi)的某些與心臟發(fā)育相關(guān)的因子 (如Nkx2.5)的功能或表達量，從而引起了心臟發(fā)育異常。已有研究證實敲除小鼠的Nkx2.5基因，小鼠因心臟發(fā)育障礙和生長遲緩而死亡［10］。有文獻認為Nkx2.5基因表達量的減少會引起心臟傳導(dǎo)細胞數(shù)的減少，從而引起心臟發(fā)育異常［11］?？梢奛kx2.5基因表達的減少與心臟發(fā)育異常密切相關(guān)。本實驗發(fā)現(xiàn)Nkx2.5蛋白及其mRNA在實驗組表達在孕早期較對照組下降，同時也發(fā)現(xiàn)實驗組胎兒心臟畸形的例數(shù)較對照組增多，符合以上文獻的報道。因此我們推測Nkx2.5可能參與了妊娠期糖尿病致胎兒心臟發(fā)育異常的過程，且是通過表達下降來干預(yù)的。另外，本實驗觀察到實驗組Nkx2.5mRNA的表達在孕15 d與對照組相比是增加的，而其同期蛋白的表達卻比對照組下降，這并不矛盾，蛋白質(zhì)的合成過程復(fù)雜且受多種因素調(diào)節(jié)，近年來研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DNA轉(zhuǎn)錄為mRNA后，還可能受到microRNA及長鏈非編碼RNA等因子的轉(zhuǎn)錄后翻譯水平的負調(diào)節(jié)。有研究報道，高糖狀態(tài)下可引起某些 microRNA的表達增多［12］，而 microRNA可與靶mRNA互補配對，導(dǎo)致mRNA的翻譯抑制或降解，從而使蛋白質(zhì)的表達下調(diào)［13－16］。因此，在妊娠期糖尿病致胚胎心臟畸形的過程中，心臟發(fā)育關(guān)鍵基因的表達是否還受microRNA的調(diào)節(jié)，還需進一步加以證實。

Nkx2.5在心臟發(fā)育中具有重要作用，但是心臟的發(fā)育過程受多個因子調(diào)控，這些因子相互作用，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，Nkx2.5表達異常對心臟發(fā)育的致畸作用可能還依賴于其他的遺傳或上位因素［17］。妊娠期糖尿病中，Nkx2.5具體通過何種方式參與胎兒心臟的異常發(fā)育，尚需要進一步的研究來證實。

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