崔嘉真黃建勝朱乃碩△

（1復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2微生物感染與免疫實(shí)驗(yàn)室 上海 200438；3復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院 上海 200032）

產(chǎn)KPC酶超耐藥阿斯腸桿菌Eah7的發(fā)現(xiàn)及其耐藥伴生質(zhì)粒的遺傳特征

崔嘉真1，2，3黃建勝1，2，3朱乃碩1，2，3△

（1復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2微生物感染與免疫實(shí)驗(yàn)室 上海 200438；3復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院 上海 200032）

目的 分析1株亞胺培南抗性阿斯腸桿菌（Enterobacter asburiae）的耐藥機(jī)制及其遺傳特征。方法Vitek-2 Compact系統(tǒng)初步鑒定菌株并測(cè)定抗生素最小抑菌濃度，對(duì)16s rRNA基因測(cè)序以確定菌株；PCR法擴(kuò)增β-內(nèi)酰胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)等17種耐藥基因并測(cè)序確認(rèn)；以CaCl2誘導(dǎo)的化學(xué)法轉(zhuǎn)化質(zhì)粒；構(gòu)建伴生質(zhì)粒DNA文庫(kù)并測(cè)序，以Glimmer 3.02和BLASTP軟件注釋并預(yù)測(cè)伴生質(zhì)粒序列的編碼基因功能；采用接合試驗(yàn)驗(yàn)證伴生質(zhì)粒對(duì)耐藥性質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的作用。結(jié)果該菌株為阿斯腸桿菌，對(duì)亞胺培南等15種β-內(nèi)酰胺及氨基糖苷類(lèi)抗生素耐藥，僅對(duì)左氧氟沙星和環(huán)丙沙星敏感；該菌株同時(shí)含有2種質(zhì)粒，其中耐藥性質(zhì)粒p Ea-1攜帶耐藥基因blaKPC-2、blaCTX-M-15和blaTEM-1，而伴生質(zhì)粒p Ea-2則攜帶4種轉(zhuǎn)移蛋白基因mob A、mob B、mob C和mob D；p Ea-2可促進(jìn)耐藥質(zhì)粒pEa-1接合轉(zhuǎn)移。結(jié)論在國(guó)內(nèi)首次報(bào)道了產(chǎn)KPC-2酶的阿斯腸桿菌，該菌攜帶的質(zhì)粒p Ea-2具有促進(jìn)耐藥性質(zhì)粒p Ea-1接合轉(zhuǎn)移的作用。

阿斯腸桿菌； 耐藥質(zhì)粒； 伴生質(zhì)粒

【Abstraet】 Objcetivc To analyze the drug-resistant mechanism and genetic characteristics of a strain of imipenem-resistant Enterobacter asburiae. Mcthods The strain and its antibiotics minimum inhibitory concentration was identified by Vitek-2 Compact System，then it was determined by sequencing its 16s r RNA gene.Seventeen genes includingβ-lactamase resistance gene，quinolone resistance gene and aminoglycoside resistance gene were detected by PCR method and confirmed by sequencing.The plasmid of Enterobacter asburiae was transformed by CaCl2-induced chemical method.

Associated plasmid DNA library was constructed and sequenced.We annotated and predicted encoding function of the associated plasmid by Glimmer 3.02 and BLASTP.The role of the associated small plasmid on transferring to the drug-resistant plasmid was verified by conjugation. Rcsults This strain belonged to Enterobacter asburiae.It was resistant to 15 kinds ofβ-lactam antibiotics，such as imipenem and aminoglycoside antibiotics，but it was sensitive to levofloxacin and ciprofloxacin.This strain contained kinds of plasmids.The drug-resistant plasmid p Ea-1 carried resistance genes blaKPC-2，blaCTX-M-15and blaTEM-1，while the associated plasmid p Ea-2 carried 4 mobilization proteins genes called mob A，mob B，mob C and mob D.pEa-2 might promote the conjugation of drug-resistant plasmid p Ea-1. Conelusions It is the first time to report that a strain of Enterobacter asburiae can produce KPC-2 enzyme in China，and plasmid p Ea-2 carried by the strain might promote the conjugation of drugresistant plasmid pEa-1.

【Kcy words】 Enterobacter asburiae； drug-resistant plasmid； associated plasmid

*This work was supportcd by thc National Seicnec and Tcehnology Major Projcet（2012ZX10002006-002-003），863 Biologieal Mcdieinc high-tceh Projcet（2011AA02A114），Seicnec Fund of Shanghai Seicnec and Tcehnology Commission（13431900602）and thc National Natural Seicnec Foundation of China（30571650，31370927）.

近年來(lái)，由于抗生素的過(guò)度使用，病原菌在選擇壓力下不斷獲得新的耐藥基因而形成超級(jí)耐藥菌，已成為人類(lèi)生存的重大威脅。β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素是目前臨床抗感染常用藥物。病原菌表達(dá)的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrumβ-lactamase，ESBL）主要包括TEM、SHV、CTX-M、可水解青霉素類(lèi)抗生素、頭孢菌素和單環(huán)類(lèi)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素［1］。亞胺培南、美洛培南及厄他培南等碳青霉烯類(lèi)抗生素是治療革蘭陰性菌引起的重癥感染的一線(xiàn)藥物，也是治療產(chǎn)ESBL菌感染的最后的有效藥物［1］。然而，碳青霉烯酶能夠水解包括碳青霉烯類(lèi)抗生素在內(nèi)的幾乎所有β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素［2］。KPC酶（Klebsiella pneumoniae carbapenemase）屬于A類(lèi)碳青霉烯酶，其編碼基因blaKPC大多位于質(zhì)粒上，可在菌株間迅速傳播，對(duì)臨床抗感染治療產(chǎn)生嚴(yán)重威脅［1-2］。自2001年Yigit等［3］首次在肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)blaKPC基因以來(lái)，已報(bào)道blaKPC-2～blaKPC-15共14種亞型（blaKPC-1和blaKPC-2相同［4］），且產(chǎn)KPC酶的耐藥菌也呈全球擴(kuò)散趨勢(shì)［5］。

阿斯腸桿菌（Enterobacter asburiae）屬于革蘭陰性腸桿菌，為機(jī)會(huì)感染菌，通常不致病。我們?cè)谶M(jìn)行院內(nèi)感染耐藥菌群研究時(shí)發(fā)現(xiàn)1株超耐藥性阿斯腸桿菌。該菌含有耐藥基因blaTEM-1、blaCTX-M-15及blaKPC-2，且位于同一質(zhì)粒p Ea-1上；同時(shí)攜帶一伴生小質(zhì)粒p Ea-2，大小為3 788 bp。本研究旨在對(duì)臨床分離的超耐藥阿斯腸桿菌Ea H7株的特性及其所含的2種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特征、基因序列、協(xié)同關(guān)系及可能的伴生機(jī)制進(jìn)行分析和研究。

材料和方法

菌株來(lái)源阿斯腸桿菌Ea H7分離自浙江省麗水市中心醫(yī)院住院患者，大腸埃希菌J53AzR（AMPsNa N3r）由本實(shí)驗(yàn)室保藏，Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。大腸埃希菌V517［6］由復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院王明貴教授惠贈(zèng)。

主要儀器及試劑Vitek-2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌分析鑒定系統(tǒng)、AST-GN13藥敏卡（美國(guó)Bio Mérieux公司），Veriti?PCR儀（品牌：Applied Biosystems）及3730XI DNA Analyzer（48）測(cè)序儀（美國(guó)Life Technologies公司），AxyPrep質(zhì)粒DNA抽提試劑盒（美國(guó)Axygen公司），p EASYTM-T5 Zero克隆載體（北京全式金生物技術(shù)有限公司），Sac I、Kpn I限制性?xún)?nèi)切酶（日本TaKaRa公司）等。

菌株鑒定按操作說(shuō)明以Vitek-2 Compact系統(tǒng)初步鑒定菌株。然后以通用引物1492R和27FHT擴(kuò)增其16s r RNA基因并測(cè)序，最終鑒定其菌種。

藥敏試驗(yàn)采用Vitek-2 Compact系統(tǒng)ASTGN13藥敏卡測(cè)定18種臨床常用抗生素最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）值，包括氨芐西林、舒巴坦、阿米卡星、氨曲南、甲氧芐氨嘧啶、頭孢替坦、頭孢曲松、頭孢唑啉、頭孢吡肟、頭孢他啶、慶大霉素、呋喃妥因、妥布霉素、亞胺培南、厄他培南、哌拉西林、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星。根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）2012年標(biāo)準(zhǔn)讀取結(jié)果，以大腸埃希菌ATCC25922為質(zhì)控對(duì)照。

耐藥基因檢測(cè)PCR法檢測(cè)以下β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)blaKPC、blaVIM、blaIMP、blaSIM、blaGIM、blaSPM、blaOXA、blaTEM、blaSHV、blaCTX-M，喹諾酮類(lèi)qnr A、qnrB、qnrC、qnr D、qnrS、qep A及氨基糖苷類(lèi)aac （6'）-Ib-cr共17種耐藥基因。引物如前述［7］，PCR參數(shù)設(shè)置：94℃變性3 min；然后94℃下30 s，55℃下30 s，72℃下60 s，循環(huán)30次；最后72℃延伸5 min。以實(shí)驗(yàn)室保存的臭鼻克雷伯菌Ko6 （blaKPC）、肺炎克雷伯菌（blaIMP）、銅綠假單胞菌（blaVIM）及鮑曼不動(dòng)桿菌（blaOXA）為陽(yáng)性對(duì)照。

質(zhì)粒抽提及轉(zhuǎn)化按照操作說(shuō)明以Axy Prep質(zhì)粒DNA抽提試劑盒抽提質(zhì)粒；以CaCl2誘導(dǎo)的化學(xué)法［7］轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1，用含氨芐青霉素100μg/m L的LB固體培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子。

小質(zhì)粒DNA文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序分析按照操作說(shuō)明以Sac I和Kpn I酶切質(zhì)粒，并將酶切產(chǎn)物克隆至p EASYTM-T5 Zero載體。按照說(shuō)明書(shū)用M13引物（p EASYTM-T5 Zero載體試劑盒提供）進(jìn)行PCR鑒定重組子，產(chǎn)物送鉑尚生物公司測(cè)序之后進(jìn)行BLAST對(duì)比分析，根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)新的引物，采用步移法測(cè)通全質(zhì)粒。以Glimmer 3.02和BLASTP軟件注釋并預(yù)測(cè)其功能。

接合實(shí)驗(yàn)以大腸埃希菌J53AzR（AMPsNa）為受體菌，分別以阿斯腸桿菌Ea H7和耐藥質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子EEa為供體菌進(jìn)行接合實(shí)驗(yàn)［8］。分別取Ea H7、EEa及J53單菌落少許，接種至5 m L LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)6 h，取Ea H7 0.5 m L +J53菌懸液0.5 m L和EEa 0.5 m L+J53菌懸液0.5 m L分別加至4 m L新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37℃靜態(tài)過(guò)夜培養(yǎng)。MH固體篩選培養(yǎng)基中疊氮化鈉及氨芐青霉素篩選濃度分別為110μg/m L和100μg/m L。重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次，挑單菌落，測(cè)其16s r RNA基因以排除假陽(yáng)性接合子。

結(jié) 果

菌株鑒定該菌經(jīng)Vitek-2 Compact系統(tǒng)鑒定為阿斯腸桿菌，其16s r RNA基因序列與標(biāo)準(zhǔn)阿斯腸桿菌LF7a菌株（NR_074722.1）99％一致，因此確定該菌株為阿斯腸桿菌，命名為Ea H7。

Eah7耐藥性Ea H7對(duì)多種抗生素耐藥，包括氨芐西林、舒巴坦、阿米卡星、氨曲南、甲氧芐氨嘧啶、頭孢替坦、頭孢曲松、頭孢唑啉、頭孢吡肟、頭孢他啶、慶大霉素、呋喃妥因、妥布霉素、亞胺培南、厄他培南、哌拉西林等；Ea H17僅對(duì)左氧氟沙星和環(huán)丙沙星敏感（表1）。

表1 Eah7對(duì)多種抗生素藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Drug scnsitivity assay of Eah7 against various of antimierobials

耐藥基因檢測(cè)經(jīng)PCR檢測(cè)blaKPC、blaTEM及blaCTX-M3種基因擴(kuò)增呈陽(yáng)性，經(jīng)BLAST比對(duì)，三者分別與blaKPC-2（GenBank編號(hào)：FJ628167.2）、blaTEM-1（GenBank編號(hào)：HM131427.1）及blaCTX-M-15（GenBank編號(hào)：KF155155.1）序列100％一致。其余耐藥基因blaVIM、blaIMP、blaSIM、blaGIM、blaSPM、blaOXA、blaSHV、qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qep A、aac（6'）-Ib-cr等共14種PCR擴(kuò)增均呈陰性。

質(zhì)粒分析Ea H7菌株質(zhì)粒電泳結(jié)果可見(jiàn)在54 kb及3.9 kb處均有一質(zhì)粒條帶，分別命名為p Ea-1 和p Ea-2（圖1）。將Ea H7菌株質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1，抽提質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)得到只含有p Ea-1的轉(zhuǎn)化子EEa。

接合實(shí)驗(yàn)以Ea H7為供體菌，J53為受體菌，經(jīng)篩選共挑取25個(gè)單菌落，測(cè)其16s rRNA基因，結(jié)果有10個(gè)陽(yáng)性接合子，并且只有pEa-1轉(zhuǎn)移至J53中，抽提接合子（命名JEa）質(zhì)粒（圖1）；而以轉(zhuǎn)化子EEa為供體菌，J53為受體菌，經(jīng)篩選，無(wú)接合子生長(zhǎng)。

圖1 Eah7、EEa和JEa抽提質(zhì)粒電泳圖Fig 1 Plasmid cxtraetion clcetrophorcgram of Eah7，EEa and JEa

blaKPC-2基因結(jié)構(gòu)分析blaKPC-2基因及其兩側(cè)測(cè)序長(zhǎng)14 091 bp，經(jīng)BLAST對(duì)比分析其與GenBank CP006657.1相似度達(dá)99％。blaKPC-2周?chē)瑯佑蒚n3、部分Tn4401及Tn1721構(gòu)成（圖2）。Tn4401由Tn4401轉(zhuǎn)座酶、Tn4401解離酶、blaKPC-2、IS Kpn6、IS Kpn7組成，是美國(guó)、希臘等地區(qū)常見(jiàn)攜帶blaKPC-2的可移動(dòng)元件［9］。p Ea-1中只有長(zhǎng)度為2 070 bp，包括blaKPC-2及類(lèi)似IS Kpn6的片段與Nass等［9］報(bào)道的Tn4401相似。

測(cè)序發(fā)現(xiàn)在blaKPC-2基因上游存在一個(gè)Tn3轉(zhuǎn)座子，以?xún)啥?8 bp的反向重復(fù)（inverted repeat，IR）序列和3 bp的插入位點(diǎn)重復(fù)TSD（TAA）為界，由Tn3轉(zhuǎn)座酶、Tn3解離酶和插入序列IS Kpn8組成。其中IS Kpn8屬于IS481家族，形成6 bp的TSD（ATAGGT）。在blaKPC-2基因下游還發(fā)現(xiàn)另外1個(gè)轉(zhuǎn)座子Tn1721，它以?xún)啥说姆聪蛑貜?fù)序列IRL 和IRR為界，由Tn1721轉(zhuǎn)座酶和Tn1721解離酶組成。

pEa-2序列特征p Ea-2測(cè)序全長(zhǎng)3 788 bp，有6個(gè)編碼序列（coding sequence，CDS），分別編碼4種轉(zhuǎn)移蛋白Mob A、MobB、MobC和MobD，DNA復(fù)制蛋白及DUF304結(jié)構(gòu)域，并存在復(fù)制起始區(qū)rep-origin、轉(zhuǎn)移起始區(qū)ori T、轉(zhuǎn)移基點(diǎn)區(qū)bom （basis of mobility）等（圖3）。然而，pEa-2不攜帶耐藥性相關(guān)基因。

圖2 blaKPC-2遺傳結(jié)構(gòu)圖Fig 2 Thc gcnctie strueturc of blaKPC-2

圖3 阿斯腸桿菌Eah7質(zhì)粒pEa-2圖譜Fig 3 Atlas of thc plasmid pEa-2 of Eah7

p Ea-2屬于RNA調(diào)控的復(fù)制子，復(fù)制起始區(qū)包含RNAⅡ和RNAⅠ。RNAⅡ是復(fù)制起始的引物，RNAⅠ（即反義RNA分子）能與RNAⅡ相互作用，抑制引物的形成［10-11］。RNAⅡ和RNAⅠ區(qū)域位于復(fù)制起始的上游，有各自的-10和-35序列，并且高度保守［10-11］。p Ea-2與質(zhì)粒ColE1（GenBank編號(hào)：J01566）、p RK10（GenBank編號(hào)：EU697813）和pSW200（GenBank編號(hào)：L42525）的RNAⅡ、RNAⅠ及各自的-10和-35序列對(duì)比見(jiàn)圖4。bom區(qū)（與Genebank JX457478.1有80％相似）覆蓋ori T區(qū)，位于4種轉(zhuǎn)移蛋白上游，是質(zhì)粒轉(zhuǎn)移所需的順式作用元件。p Ea-2與ColE1、pSW200、p RK10質(zhì)粒轉(zhuǎn)移蛋白基因相似度對(duì)比見(jiàn)表2。

圖4 p Ea-2、ColE1、p RK10和pSW200部分復(fù)制起始區(qū)多序列對(duì)比圖Fig 4 Multiplc scqucnec alignmcnt of partial rcplieaionorigin of pEa-2，ColE1，pRK10 and pSW200

表2 pEa-2與ColE1、pSW200、pRK10質(zhì)粒轉(zhuǎn)移蛋白基因相似度對(duì)比Tab 2 Comparison of gcnc of mobilization protcins with ColE1，pSW200 and p RK10 to p Ea-2

討 論

阿斯腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素天然不耐藥，本研究發(fā)現(xiàn)的阿斯腸桿菌Ea H7是臨床混合感染肺炎克雷伯菌［7］標(biāo)本中分離到的，對(duì)15種β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥或中等耐藥，尤其是對(duì)亞胺培南及厄他培南具有耐藥性（MIC分別為≥16及≥8μg/mL）。PCR檢測(cè)β-內(nèi)酰胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)等17種耐藥基因，發(fā)現(xiàn)其含有ESBL抗性基因blaTEM-1、blaCTX-M-15及碳青霉烯酶基因blaKPC-2，且位于同一質(zhì)粒pEa-1上，3種基因可能是導(dǎo)致EaH7產(chǎn)生超耐藥性的主要原因。

KPC型碳青霉烯酶基因常見(jiàn)于肺炎克雷伯菌中，在腸桿菌屬中較少見(jiàn)，在阿斯腸桿菌中更為少見(jiàn)。Hossain等［12］于2004年首次報(bào)道了1株由質(zhì)粒介導(dǎo)的含有KPC基因的腸桿菌屬菌株；Mathers等［13］于2011年首次報(bào)道1株能合成碳青霉烯酶的阿斯腸桿菌。國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。

而Ea H7同時(shí)攜帶的另一小質(zhì)粒p Ea-2不攜帶耐藥基因，但是攜帶4種轉(zhuǎn)移蛋白Mob A、MobB、MobC和MobD。這4種轉(zhuǎn)移蛋白被認(rèn)為是接合作用中介導(dǎo)基因水平轉(zhuǎn)移所必需的［14-15］，轉(zhuǎn)移蛋白結(jié)合相關(guān)輔助蛋白，形成1個(gè)松弛體，以特定的方式切割雙鏈DNA。轉(zhuǎn)移蛋白Mob A結(jié)合MobB和MobC，切割質(zhì)粒同一條鏈的GC位點(diǎn)，然后結(jié)合到DNA鏈的5＇端，進(jìn)而轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，Mob A還參與轉(zhuǎn)移的終止［14］。Mob D也參與質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，但具體功能不詳［14］。Bravo-Angel等［15］將含有Mob A和ori T區(qū)的一種改造質(zhì)粒p Mob和另一種含有T-DNA和ori T的質(zhì)粒（能夠與p Mob共存）共轉(zhuǎn)移到土壤農(nóng)桿菌中，然后轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞，檢測(cè)植物細(xì)胞中的TDNA含量，證明了Mob A的促進(jìn)轉(zhuǎn)移及整合功能，并同時(shí)說(shuō)明了Mob A可以轉(zhuǎn)移含有與自身質(zhì)粒相同ori T區(qū)的質(zhì)粒。另外，Dery等［11］將pJHCMW1質(zhì)粒上含有ori T區(qū)的片段克隆至p ROXT1質(zhì)粒上并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5a，得到轉(zhuǎn)化子大腸埃希菌DH5a（p ROXT1）。在接合實(shí)驗(yàn)中，只有同時(shí)加入含有轉(zhuǎn)移蛋白Mob基因的大腸埃希菌DH5a （p RK2073）時(shí)，p ROXT1才能轉(zhuǎn)移至受體菌中，同樣證明了Mob基因的促進(jìn)轉(zhuǎn)移功能。本研究在進(jìn)行接合試驗(yàn)時(shí)，只有耐藥質(zhì)粒p Ea-1能夠轉(zhuǎn)移至受體菌，而將只含有p Ea-1的轉(zhuǎn)化子EEa接合到受體菌時(shí)并未得到接合子，推測(cè)p Ea-1可借助p Ea-2編碼的轉(zhuǎn)移蛋白Mob A、MobB、MobC和Mob D進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移。

對(duì)于blaKPC類(lèi)新型的耐藥基因，從發(fā)現(xiàn)到普遍存在于各種致病菌中只有十幾年時(shí)間，耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移是其快速分布的原因，其中接合作用便是其方式之一［16］。本研究發(fā)現(xiàn)1株超耐藥阿斯腸桿菌，耐藥基因blaTEM-1、blaCTX-M-15及blaKPC-2均位于p Ea-1上，而其攜帶的另一小質(zhì)粒p Ea-2具有促進(jìn)耐藥性質(zhì)粒p Ea-1接合轉(zhuǎn)移的作用。我們將進(jìn)一步通過(guò)基因敲除等方法明確伴生小質(zhì)粒促進(jìn)耐藥性質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

［1］ 張劍，杜英姿，王能一，等.ESBLs的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與臨床，2008，19（2）：80-82.

［2］ Canton R，Akova M，Carmeli Y，et al.Rapid evolution and spread of carbapenemases among Enterobacteriaceae in Europe［J］.Clin Microbiol Infect，2012，18（5）：413-431.

［3］ Yigit H，Queenan AM，Anderson GJ，et al.Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase，KPC-1，from a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumoniae［J］. Antimicrob Agents Chemother，2001，45（4）：1151-1161.

［4］ Yigit H，Queenan AM，Anderson GJ，et al.Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase，KPC-1，from a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumoniae（vol 45，pg 1151，2001）［J］.Antimicrob Agents Chemother，2008，52（2）：809.

［5］ 紀(jì)明宇，耿大影，裴鳳艷，等.KPC型碳青霉烯酶研究概況及進(jìn)展［J］.臨床檢驗(yàn)雜志，2013，31（4）：282-285.

［6］ 王明貴，Tran JH，Jacoby GA，等.大腸埃希菌臨床分離株對(duì)喹諾酮類(lèi)抗菌藥的質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥［J］.中國(guó)感染與化療雜志，2006，6（4）：217-221.

［7］ Huang J，Li X，Zhu N，et al.Genetic characteristics of one highly multi-drug-resistant strain of Klebsiella ozaenae ［J］.J Med Microbiol，2012，61（9）：1303-1305.

［8］ Wang MG，Tran JH，Jacoby GA，et al.Plasmid-mediated quinolone resistance in clinical isolates of Escherichia coli from Shanghai，China［J］.Antimicrob Agents Chemother，2003，47（7）：2242-2248.

［9］ Naas T，Cuzon G，Villegas M，et al.Genetic structures at the origin of acquisition of the beta-lactamase blaKPCgene ［J］.Antimicrob Agents Chemother，2008，52（4）：1257 -1263.

［10］ Selzer G，Som T，Itoh T，et al.The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids［J］.Cell，1983，32（1）：119-129.

［11］ Dery KJ，Chavideh R，Waters V，et al.Characterization of the replication and mobilization regions of the multiresistance Klebsiella pneumonia plasmid pJHCMW1［J］.Plasmid，1997，38（2）：97-105.

［12］ Hossain A，F(xiàn)erraro MJ，Pino RM，et al.Plasmid-mediated carbapenem-hydrolyzing enzyme KPC-2 in an Enterobacter sp［J］.Antimicrob Agents Chemother，2004，48（11）：4438-4440.

［13］ Mathers AJ，Cox HL，Kitchel B，et al.Molecular dissection of an outbreak of carbapenem-resistant enterobacteriaceae reveals intergenus KPC carbapenemase transmission through a promiscuous plasmid［J］.MBio，2011，2（6）：e00204-e00211.

［14］ Syed Ibrahim K，Bakkiyaraj D，James R，et al.Isolation and sequence analysis of a small cryptic plasmid p RK10 from a corrosion inhibitor degrading strain Serratia marcescens ACE2［J］.Plasmid，2009，62（3）：183-190.

［15］ Bravo-Angel AM，Gloeckler V，Hohn B，et al.Bacterial conjugation protein Mob A mediates integration of complex DNA structures into plant cells［J］.J Bacteriol，1999，181 （18）：5758-5765.

［16］ Seitz P，Blokesch M.Cues and regulatory pathways involved in natural competence and transformation in pathogenic and environmental Gram-negative bacteria［J］. FEMS Microbiol Rev，2013，37（3）：336-363.

Dctcetion of a strain of ultra-drug-rcsistant Enterobacter asburiae eallcd Eah7 produeing KPC cnzymc and thc gcnctie eharaetcristies of its rcsistant-assoeiatcd plasmid

CUI Jia-zhen1，2，3，HUANG Jian-sheng1，2，3，ZHU Nai-shuo1，2，3△
（1State Key Laboratory of Genetic Engineering，2Laboratory of Microbial Infection and Immunity，
School of Life Sciences，F(xiàn)udan University，Shanghai 200438，China；3Institute of Biomedical Science，F(xiàn)udan University，Shanghai 200032，China）

Q 933

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2015.06.003

2015-03-27；編輯： 段佳）

國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2012ZX10002006-002-003）；863生物醫(yī)藥高科技課題（2011AA02A114）；上海市科委科學(xué)基金（13431900602）；國(guó)家自然科學(xué)基金（30571650，31370927）

△Corresponding author E-mail：nzhu@fudan.edu.cn