鐘傳青，姜天翼，王靜，張春明

（山東建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，山東 濟(jì)南250101）

0 引言

增強(qiáng)型生物除磷工藝EBPR（enhanced biological phosphorus removal）是目前普遍使用的生物除磷技術(shù)，除磷效率是普通生物除磷工藝的3～7倍［1－3］。EBPR工藝的基本原理為聚磷菌 PAOs（phosphate accumulation organisms）在厭氧／好氧交替環(huán)境中進(jìn)行放磷和過(guò)量吸磷過(guò)程，然后通過(guò)排放污泥進(jìn)行除磷。在厭氧階段 PAOs吸收揮發(fā)性脂肪酸 VFAs（volatile fatty acids）轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)碳源 PHA（poly-βhydroxyalkanoates）并儲(chǔ)存起來(lái)；在好氧階段PAOs分解PHA，獲得的能量用于細(xì)胞生長(zhǎng)和過(guò)量攝取磷元素，并以多聚磷酸鹽 Poly-P（Polyphosphate）的形式蓄積，最終活性污泥的含磷量可大于10%［4－7］。

PAOs是一類微生物的總稱，主要包括不動(dòng)桿菌屬、紅環(huán)菌屬、氣單胞菌屬、棒桿菌屬、腸球菌屬、葡萄球菌屬和放線菌綱等，還沒(méi)有證據(jù)證明哪類PAOs在 EBPR系統(tǒng)中占主導(dǎo)地位［8－10］。傳統(tǒng)定義的PAOs要求微生物具有兩個(gè)特征：（1）厭氧階段合成聚羥基烷PHAs（Poly-hydroxy-alkanoates）和好氧階段合成Poly-P；（2）厭氧和好氧階段交替過(guò)程中有Poly-P和PHAs相互的轉(zhuǎn)換。已有研究表明并不是所有聚磷微生物都有Poly-P和PHAs循環(huán)，目前對(duì)PAOs的定義更傾向于“一切能夠超過(guò)自身生長(zhǎng)所需過(guò)量吸收磷的微生物”［11］。因此，闡明 PAOs種類、聚磷特性及各菌株在EBPR系統(tǒng)中的地位一直是生物除磷研究的重要方向。

文章從高新區(qū)污水處理廠活性污泥中分離到一株聚磷菌JN459，對(duì)其微生物學(xué)分類地位進(jìn)行了鑒定，同時(shí)研究了該菌株在純培養(yǎng)條件下的聚磷特性，研究結(jié)果可為深入研究Microlunatus phosphovorus（M.phosphovous）聚磷代謝的分子調(diào)控機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

活性污泥來(lái)自濟(jì)南市高新區(qū)污水處理廠。

1.2 污水水質(zhì)

市政污水來(lái)自濟(jì)南市高新區(qū)污水處理廠的進(jìn)水，水質(zhì)參數(shù)有：化學(xué)需氧量（COD）為 247 mg／L，氨態(tài)氮（NH4＋-N）為 63.3 mg／L，磷酸根（PO34-P）為13.5 mg／L。

人工合成污水成分為：葡萄糖為0.3 g、蛋白胨為 0.1 g、酵母粉為0.01 g、醋酸鈉為 0.15 g、氯化銨為 0.2 g、氯化鈉為 0.05 g、磷酸氫二鉀為 0.1 g、硫酸鎂為0.12 g、純化水為1 L。實(shí)測(cè)NH＋4-N為65.1 mg／L，PO3－4-P為14.2 mg／L。

1.3 SBR反應(yīng)器

10 L體積的實(shí)驗(yàn)室序列間歇式SBR（sequencing batch reactor）反應(yīng)器（由小型發(fā)酵罐改裝），具備在線滅菌、在線溫度控制、在線pH檢測(cè)與溶解氧DO（Dissolved oxygen）檢測(cè)、空氣與氮?dú)饬髁靠刂频裙δ堋?/p>

1.4 菌株的分離與篩選

取10 mL的活性污泥樣品，用40 mL的磷酸鹽溶液（5 mg／L的三聚磷酸鈉和8.5 g／L的氯化鈉）稀釋后均質(zhì)，梯度稀釋后涂布到 R2YA培養(yǎng)基（0.5 g的酵母粉、0.5 g的蛋白胨、0.5 g的酪蛋白氨基酸、0.5 g的葡萄糖、0.5 g的可溶性淀粉、0.3 g的丙酸鈉、0.3 g的磷酸氫二鉀、0.03 g的硫酸鎂、20 g的瓊脂粉和1 L的純化水），在25℃溫度下培養(yǎng)，挑取單菌落。菌株形態(tài)、異染顆粒染色和生理生化特征測(cè)定根據(jù)文獻(xiàn)進(jìn)行［12－13］。

1.5 16SrDNA分析

用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)JN459菌株，提取該菌株總DNA，用高保真DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR（polymerase chain reaction）擴(kuò)增其16SrDNA。將PCR產(chǎn)物連接到中間載體進(jìn)行DNA測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)，并與GenBank／EMBL／DDBJ中已知序列進(jìn)行同源性分析。

1.6 菌株純培養(yǎng)和磷吸收試驗(yàn)

將JN459株液體培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心收集菌體，并用無(wú)菌水洗滌，然后接種到SBR反應(yīng)器中。吸磷和放磷試驗(yàn)采用好氧－缺氧工藝，pH值控制為7.0，每個(gè)循環(huán)過(guò)程中好氧時(shí)間為2 h，溶解氧濃度約為4 mg／L；缺氧時(shí)間為2 h，用N2置換體系中O2，維持溶解氧濃度低于0.2 mg／L；最后，靜置時(shí)間為2 h，整個(gè)工藝維持約2 d，無(wú)菌體沉降和出水過(guò)程。每30 min取樣檢測(cè)水相中磷含量，每個(gè)試驗(yàn)方案重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 JN459菌株的生理生化特征

通過(guò)單菌分離和純培養(yǎng)技術(shù)從活性污泥中分離得到一株球菌，編號(hào)為JN459。該菌最適生長(zhǎng)溫度為25～30℃，最高耐受溫度40℃，最低生長(zhǎng)溫度5℃；最適生長(zhǎng)的pH值為7，最低的生長(zhǎng)pH值為4，最高生長(zhǎng)的 pH值為 9。JN459菌體直徑約1.5μm，顯微鏡觀察可見(jiàn)單個(gè)或2～4個(gè)菌體聚集，無(wú)運(yùn)動(dòng)性，革蘭氏染色陽(yáng)性，亞甲基藍(lán)染色可見(jiàn)由Poly-P構(gòu)成的異染顆粒。JN459為兼性好氧菌，過(guò)氧化氫酶呈陽(yáng)性，但氧化酶活性較弱，在無(wú)氧條件下可以將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，不能利用亞硝酸鹽。JN459可以利用的碳源包括淀粉、L—山梨糖、D—阿拉伯糖、甘油、甘露醇、乙酸和絲氨酸，不能利用乳糖、丙酸、蘋(píng)果酸、丙氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 JN459的生理生化特征

2.2 菌株JN459的16 S rDNA鑒定

16 S rDNA序列測(cè)序結(jié)果顯示，JN459菌株16 S rDNA的 PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 1444 bp，與M.phosphovorus NM-1菌株的16 S rDNA僅有2個(gè)堿基不同，相似度達(dá)到 99.8%。JN459菌株 16 S rDNA的同源性分析如圖1所示。綜合其形態(tài)特征和生理生化鑒定試驗(yàn)結(jié)果，確定JN459菌株為M.phosphovorus。M.phosphovorus是 1995年從EBPR系統(tǒng)分離得到的聚磷菌，具有顯著的聚磷效果，Poly-P可以達(dá)到其菌體干重的10%，熒光標(biāo)記原位雜交技術(shù) FISH（fluorescence in situ hybridization）分析結(jié)果顯示 M.phosphovorus占EBPR總 菌 群 2.7%，占 PAOs 9%［14－15］。但 是M.phosphovorus在厭氧階段無(wú)明顯釋磷現(xiàn)象，與其它PAOs好氧吸磷和厭氧釋磷的特點(diǎn)有顯著差異，提示M.phosphovorus在磷代謝途徑上存在獨(dú)特的調(diào)控機(jī)制。

圖1 基于JN459 16 S rDNA序列同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖

2.3 JN459的聚磷特性

用SBR檢測(cè)好氧－缺氧工藝條件下JN459的吸磷和放磷曲線如圖2所示。由圖2可以看出，以人工合成污水為進(jìn)水時(shí)，JN459在好氧階段攝取體系中大部分可溶性磷，除磷率可達(dá)93.7%，該結(jié)果與文獻(xiàn)中 M.phosphovorus的除磷效果相近［8］。在市政污水體系中JN459的除磷率為84.4%，這可能與市政污水中碳源成分比較復(fù)雜，不適合JN459菌株生長(zhǎng)代謝有關(guān)。在缺氧階段初期，體系中溶解磷沒(méi)有明顯回升趨勢(shì)，說(shuō)明JN459不具有PAOs可以大量分解PHA并釋放可溶性磷以維持菌株生長(zhǎng)的顯著特征。當(dāng)維持缺氧狀態(tài)至180 min時(shí)，人工污水和市政污水體系中溶解磷都小幅上升，在240 min時(shí)可溶性磷分別是缺氧階段初始值（120 min）的1.6和2.0倍。，說(shuō)明 JN459可以分解 Poly-P并獲取能量，但相關(guān)酶系與轉(zhuǎn)運(yùn)體系可能需要誘導(dǎo)并且表達(dá)水平較低［15－16］。

3 結(jié)論

通過(guò)本研究可知：

圖2 SBR工藝中JN459磷的吸收與釋放圖

（1）從市政污水處理廠活性污泥中分離到一株聚磷菌JN459，該菌株在好氧條件下可生成Poly-P的異染顆粒，經(jīng)生理生化實(shí)驗(yàn)及16 S rDNA分析，將JN459菌株鑒定為M.phosphovorus。M.phosphovorus是一種革蘭氏陽(yáng)性球菌，在好氧條件下能夠積累Poly-P，而在厭氧階段通過(guò)分解Poly-P提供能量幫助細(xì)菌吸收有機(jī)物，M.phosphovorus不能合成糖原，因此Poly-P是厭氧階段能量的唯一來(lái)源，這與典型的PAOs不同。

（2）好氧條件下M.phosphovorus JN459菌株的除磷率達(dá)到93.7%，在缺氧條件下初期無(wú)明顯的Poly-P分解現(xiàn)象，經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的誘導(dǎo)后溶解磷含量會(huì)上升，說(shuō)明磷代謝的酶系與轉(zhuǎn)運(yùn)體系是可誘導(dǎo)的，該結(jié)果有助于深入研究M.phosphovorus JN459聚磷代謝的分子調(diào)控機(jī)制，為將其更好地應(yīng)用到EBPR系統(tǒng)提供理論基礎(chǔ)。

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