張艷麗 賈永森 趙 刃 包巨太

（1.遷安燕山醫(yī)院，河北遷安064400；2.河北聯(lián)合大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，河北唐山063000；3.唐山市中醫(yī)醫(yī)院，河北唐山063000）

通蓮Ⅰ號(hào)方抑制小鼠食管癌移植瘤生長(zhǎng)作用及其機(jī)制研究

張艷麗1賈永森2趙 刃3包巨太2

（1.遷安燕山醫(yī)院，河北遷安064400；2.河北聯(lián)合大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，河北唐山063000；3.唐山市中醫(yī)醫(yī)院，河北唐山063000）

目的：研究通蓮I號(hào)方對(duì)食管癌Eca109細(xì)胞荷瘤小鼠的抑瘤作用及其對(duì)腫瘤組織免疫因子TNF-α、IL-6和IL-8的影響。方法：食管癌Eca109細(xì)胞接種于小鼠右前肢皮下。小鼠隨機(jī)分為模型組和通蓮I號(hào)方低、中、高劑量組，分別灌胃生理鹽水和通蓮I號(hào)方各劑量。各組連續(xù)給藥3周，末次給藥結(jié)束3周后分離小鼠瘤組織，計(jì)算抑瘤率，ELISA法檢測(cè)腫瘤組織上清液TNF-α、IL-6和IL-8含量。結(jié)果：通蓮I號(hào)方高劑量組瘤重明顯低于模型組（P＜0.05），抑瘤率明顯高于通蓮I號(hào)方低劑量組（P＜0.05）。HE染色可見，通蓮I號(hào)方高劑量組的腫瘤細(xì)胞淡染，核分裂較少，可見較多腫瘤細(xì)胞腫脹變性壞死。通蓮I號(hào)方高劑量組腫瘤組織TNF-α、IL-6和IL-8表達(dá)明顯低于模型組與通蓮I號(hào)方中、低劑量組（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論：通蓮I號(hào)方可抑制小鼠食管癌Eca109細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)，其抑瘤機(jī)制與下調(diào)瘤組織TNF-α、IL-6和IL-8等因子水平，增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。

通蓮I號(hào)方 食管癌 Eca109細(xì)胞 荷瘤小鼠 腫瘤壞死因子-α 白介素-6 白介素-8 病理學(xué)

食管癌屬于中醫(yī)“噎膈”范疇，病機(jī)多為氣滯、痰阻和血瘀阻滯食道，造成津傷血枯，食管干澀，飲食難下。有報(bào)道顯示，中國(guó)男、女食管癌發(fā)病率和死亡率均居全球第1位[1]。本研究組創(chuàng)制活血行氣復(fù)方——“通蓮I號(hào)方”治療食管癌獲得了較好的臨床療效，并已獲得國(guó)家專利[2]。前期研究表明，該方可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期抑制食管癌細(xì)胞增殖[3]，其抑癌分子機(jī)制與下調(diào)核因子kappa B（NF-κB）信號(hào)通路蛋白表達(dá)有關(guān)[4]。本研究通過荷瘤小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步觀察了通蓮I號(hào)方對(duì)食管癌移植瘤的抑制作用以及對(duì)免疫因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）和白介素8（IL-8）的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 4～5周齡昆明小鼠，雌、雄各半，體質(zhì)量20～25g，清潔級(jí)，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，合格證號(hào)：SCXK（京）2009-0017。

1.2 細(xì)胞株 食管癌Eca109細(xì)胞，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。

1.3 藥物 通蓮I號(hào)方（桃仁、紅花、升麻、檳榔、半枝蓮、白花蛇舌草，劑量比為2∶1∶1∶1∶3∶3），各單味藥物均購(gòu)于唐山市中醫(yī)醫(yī)院中藥房，由河北聯(lián)合大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室中藥制劑室制備，提取液含生藥材1.8g/mL。按人與小鼠換算比計(jì)算出高、中、低劑量（生藥量濃度分別為1500、750、375mg/L），以生理鹽水（NS）配成。

1.4 試劑 新生小牛血清（GIBCO公司），DMEM培養(yǎng)基（GIBCO公司），胰蛋白酶（GIBCO公司）；噻唑藍(lán)（MTT，Amresco公司），二甲基亞砜（DMSO，Amresco公司），IL-6、IL-8和TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（YYES BIOTECH公司），以上試劑均購(gòu)自北京科海榮京生物科技公司。

1.5 儀器 1100型無(wú)菌超凈臺(tái) （FORMA公司），3336型CO2培養(yǎng)箱 （FORMA公司），NOVAPATH 450酶標(biāo)光度計(jì) （Bio-Tek公司），TMD-2倒置式顯微鏡（NIKON公司），3MK型低溫高速離心機(jī)（SIGMA公司），JJ-2型組織勻漿機(jī)（Waring公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與給藥 小鼠隨機(jī)分為4組，分別為模型組和通蓮 I號(hào)方高、中、低劑量組。將 Eca109細(xì)胞以 1×107/mL的濃度接種于小鼠右前肢皮下，2周后成模（剔除瘤體過大或過小者）。模型組灌胃NS 10mL/kg；通蓮I號(hào)方高、中、低劑量組分別灌胃 1500、750、375mg/L中藥液，給藥量均為10mL/kg。各組均連續(xù)給藥3周，再繼續(xù)飼養(yǎng)3周后將小鼠頸椎脫臼處死，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

2.2 抑瘤率 各組小鼠處死后，取腫瘤組織于電子天平上稱取瘤重，按照如下公式計(jì)算抑瘤率：

抑瘤率=（模型組平均瘤重－給藥組平均瘤重）/模型組平均瘤重×100%

2.3 形態(tài)學(xué)觀察 取部分剝離的瘤組織以10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，制成4μm厚的切片，HE染色，光鏡下觀察瘤組織細(xì)胞形態(tài)。

2.4 ELISA法檢測(cè)移植瘤瘤體組織上清液中TNF-α、IL-6和IL-8蛋白表達(dá) 荷瘤小鼠瘤體組織取材，取樣約100mg，加入1mL生理鹽水研磨，6000r/min離心15min，取上清液。在標(biāo)準(zhǔn)品孔及待測(cè)樣本孔中分別加入50μL酶聯(lián)親和物，37℃溫育60min，反復(fù)沖洗，排除水分。分別加入顯色液A、B各50μL，室溫下避光反應(yīng)15min。加入終止液50μL，終止反應(yīng)。檢測(cè)不同濃度TNF-α、IL-6和IL-8標(biāo)準(zhǔn)品及各組瘤體組織上清液樣本。記錄上清液在450nm處的光密度值（OD），根據(jù)OD值計(jì)算各指標(biāo)含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間差別顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組平均瘤重及藥物抑瘤率比較 通蓮I號(hào)方高劑量組瘤重較小，與模型組比較有顯著性差異（P<0.05）。通蓮I號(hào)方各劑量組抑瘤率比較，高劑量組抑瘤率明顯高于低劑量組（P<0.05）。見表1。

表1 各組小鼠平均瘤重及藥物抑瘤率（±s）

表1 各組小鼠平均瘤重及藥物抑瘤率（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與通蓮I號(hào)方低劑量組比較，#P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù)（只）模型組 10通蓮I號(hào)方高劑量組 10通蓮I號(hào)方中劑量組 10通蓮I號(hào)方低劑量組 10瘤重（g） 抑瘤率（%）3.57±1.05 1.51±0.49*# 61.04±4.79# 2.28±0.87 41.39±3.08 3.05±1.29 22.56±2.74

3.2 各組小鼠皮下移植瘤組織形態(tài)學(xué)觀察 模型組瘤組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞核仁深染，腺體擁擠，血竇豐富；通蓮I號(hào)方高劑量組腫瘤細(xì)胞淡染，核分裂較少，可見較多腫瘤細(xì)胞腫脹變性壞死；通蓮I號(hào)方中、低劑量組腫瘤細(xì)胞多數(shù)深染，可見少量壞死區(qū)，但整體結(jié)構(gòu)與模型組相似。見圖1。

3.3 各組腫瘤組織上清液TNF-α、IL-6和IL-8含量比較 與模型組比較，通蓮I號(hào)方高劑量組TNF-α、IL-6和IL-8明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。通蓮I號(hào)方各劑量組組間比較，高劑量組各指標(biāo)明顯高于中、低劑量組（P＜0.05）。見表2。

圖1 各組小鼠皮下移植瘤組織形態(tài)學(xué)病理切片（×200）

表2 各組小鼠移植瘤瘤體組織TNF-α、IL-6和IL-8含量（±s） pg/mL

表2 各組小鼠移植瘤瘤體組織TNF-α、IL-6和IL-8含量（±s） pg/mL

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與通蓮I號(hào)方中劑量組比較，▲P＜0.05；與通蓮I號(hào)方低劑量組比較，#P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù)（只）IL-8 TNF-α IL-6模型組 10264.48±23.55通蓮I號(hào)方高劑量 10通蓮I號(hào)方中劑量 10通蓮I號(hào)方低劑量 10 123.30±17.64 187.67±19.80 61.82±14.43**▲# 120.49±15.61*▲# 104.56±13.58 179.12±17.54 108.78±16.32 185.35±20.79 181.09±29.51*▲# 263.66±31.49 278.15±26.34

4 討論

通蓮I號(hào)方專為食管癌氣滯血瘀、熱毒內(nèi)結(jié)而設(shè)。方中半枝蓮和白花蛇舌草清熱解毒，解除體內(nèi)之瘀毒；升麻升清，檳榔下行，一升一降，胃氣乃通；桃仁和紅花活血行氣。全方重在活血行氣、解毒散結(jié)。本研究結(jié)果表明，通蓮I號(hào)方高劑量組小鼠瘤體生長(zhǎng)受到顯著抑制，抑瘤率達(dá)到60%左右，瘤重明顯低于模型組和通蓮I號(hào)方低劑量組 （P＜0.05），可見高劑量組抑瘤作用顯著；而通蓮I號(hào)方中、低劑量組抑瘤率與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

組織形態(tài)學(xué)HE染色結(jié)果顯示，通蓮I號(hào)方高劑量組與模型組比較，瘤體組織結(jié)構(gòu)改變較明顯，瘤組織內(nèi)有大片壞死區(qū)；中、低劑量組瘤體切片中央雖然也有散在壞死區(qū)，但面積較小，深染部分占絕大多數(shù)視野，與模型組相似。表明高劑量的通蓮I號(hào)方可促進(jìn)瘤體組織壞死，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有明顯抑制作用。

免疫調(diào)節(jié)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。TNF-α是由巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞活化產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞免疫和腫瘤免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用，局部高濃度的TNF-α具有抗腫瘤活性[5]。IL-6具有多種生物學(xué)活性，可以調(diào)節(jié)其他多種因子的作用，其主要通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因，促進(jìn)腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤局部炎癥反應(yīng)和腫瘤肝細(xì)胞自我更新等多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展[6]。IL-8是由巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞等分泌的白介素亞類細(xì)胞因子，它可以通過刺激血管生成直接促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，較高水平的IL-8與腫瘤患者體重減輕、惡病質(zhì)形成有直接關(guān)系[7]。

本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠TNF-α水平最高，這和許多同類研究報(bào)道一致。本研究觀察到較高濃度的TNF-α出現(xiàn)在核仁深染、腺體擁擠、血竇豐富的模型組，這提示食管癌的TNF-α表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞活性呈正相關(guān)。而經(jīng)高劑量通蓮I號(hào)方干預(yù)的小鼠腫瘤組織中TNF-α水平顯著降低，與模型組比較有極顯著性差異（P＜0.01）。模型組小鼠IL-6和IL-8含量最高，而通蓮I號(hào)方高劑量組顯著下降，與模型組比較有顯著性差異（P＜0.05）。通蓮I號(hào)方中、低劑量組的上述三項(xiàng)指標(biāo)變化甚微，與模型組比較無(wú)顯著性差異；各劑量組間比較，高劑量組與中、低劑量組顯示出顯著性差異（P＜0.05）。本研究從免疫調(diào)節(jié)角度證明了高劑量的通蓮I號(hào)方抑制食管癌的部分機(jī)制。

綜上，通蓮I號(hào)方有較好的抑制食管癌荷瘤小鼠瘤體生長(zhǎng)作用，通過誘導(dǎo)腫瘤組織壞死，下調(diào)腫瘤組織TNF-α、IL-6和IL-8等免疫因子水平，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。需要指出的是，多靶點(diǎn)作用是中藥復(fù)方抗癌的優(yōu)勢(shì)，本研究?jī)H從宏觀瘤體變化、組織形態(tài)學(xué)和若干免疫因子差異等方面做了探討，其是否涉及與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的分子信號(hào)通路或者基因表達(dá)的變化等，值得進(jìn)一步深入探討。

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R735.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1672-397X（2015）04-0075-03

河北省自然科學(xué)基金（H2013209053）；河北省中醫(yī)藥管理局科研計(jì)劃項(xiàng)目（2014185）

張艷麗（1980-），女，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師，從事中醫(yī)內(nèi)科臨床研究工作。

賈永森，醫(yī)學(xué)博士，副教授。jysen@163. com

2014-11-15

吳 寧