李玉卿 趙文娟 夏永輝 李彥 陳靜

云南中醫(yī)學(xué)院，云南昆明650500

中藥丹參對哮喘大鼠氣道重塑及基質(zhì)金屬蛋白酶-9的影響

李玉卿 趙文娟 夏永輝 李彥 陳靜

云南中醫(yī)學(xué)院，云南昆明650500

目的研究丹參對哮喘大鼠氣道重塑和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）含量的影響。方法將SPF級SD成年雄性大鼠70只隨機(jī)分為正常對照組、哮喘模型組（哮喘2周組、哮喘4周組、哮喘8周組）、丹參干預(yù)組（丹參2周組、丹參4周組、丹參8周組）3個(gè)大組和7個(gè)小組。卵蛋白（OVA）-氫氧化鋁混懸液致敏激發(fā)大鼠復(fù)制哮喘氣道重塑模型，分別持續(xù)2、4、8周。觀察哮喘大鼠肺組織病理形態(tài)變化，采用ELISA檢測大鼠肺組織MMP-9含量。結(jié)果丹參能改善哮喘大鼠氣道炎癥細(xì)胞的浸潤及支氣管平滑肌的增厚。與正常對照組[（1.99±0.29）ng/mL]比較，哮喘4周組[（2.43±0.40）ng/mL]、哮喘8周組[（3.01±0.31）ng/mL]肺組織中MMP-9含量升高（P＜0.05、P＜0.01）；與哮喘2周組[（2.29±0.51）ng/mL]、哮喘4周組[（2.43±0.40）ng/mL]比較，哮喘8周組[（3.01±0.31）ng/mL]肺組織中MMP-9含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與哮喘8周組[（3.01±0.31）ng/mL]比較，丹參8周組[（2.10± 0.20）ng/mL]肺組織中MMP-9含量顯著降低（P＜0.01）。結(jié)論丹參能夠抑制哮喘大鼠肺組織MMP-9的分泌，改善哮喘大鼠氣道重塑狀態(tài)。

丹參；哮喘；氣道重塑；基質(zhì)金屬蛋白酶-9

支氣管哮喘（以下簡稱“哮喘”）是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。慢性炎癥導(dǎo)致患者氣道反應(yīng)性增加，隨病程延長導(dǎo)致氣道不可逆狹窄和氣道重塑。氣道重塑是哮喘的一大重要病理學(xué)特征，其本質(zhì)是氣道纖維化和膠原沉積。氣道重塑可加重氣道高反應(yīng)性，導(dǎo)致肺功能持續(xù)性、進(jìn)行性損害，從而增加臨床上哮喘的難治性[1]。

大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，活血化瘀中藥可治療和控制哮喘氣道炎癥及氣道重塑。丹參是我國傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)中應(yīng)用最早而且最廣泛的活血化瘀藥物之一，具有降低毛細(xì)血管通透性、改善微循環(huán)、保護(hù)肺功能、抗氧自由基、抗炎等作用[2]。近來也有實(shí)驗(yàn)表明，丹參可用于治療哮喘。

基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）是降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的主要成分，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MMP-9在哮喘小鼠肺組織的表達(dá)水平明顯升高，在生理和病理情況下有利于組織重構(gòu)[3]。MMP-9可作為一種顯示氣道組織破壞與修復(fù)情況的標(biāo)志[4-5]。

本實(shí)驗(yàn)通過組織病理分析和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測哮喘大鼠氣道重塑不同階段及在不同階段給予活血化瘀單味藥丹參干預(yù)后的病理特征和肺組織中MMP-9的動(dòng)態(tài)變化。為臨床治療和預(yù)防哮喘氣道重塑用藥最佳時(shí)機(jī)的選擇及使用規(guī)律提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并拓展中藥丹參調(diào)節(jié)和改善哮喘氣道重塑的新用途。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

SPF級SD成年雄性大鼠70只，4～6周齡，平均體重（180±20）g，購自四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，許可證號：SCXK（川）2013-24，合格證號：0018160，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成正常對照組、哮喘模型組（分為哮喘2周組、哮喘4周組、哮喘8周組）、丹參干預(yù)組（分為丹參2周組、丹參4周組、丹參8周組）共計(jì)3個(gè)大組，7個(gè)小組。依據(jù)分組不同分籠飼養(yǎng)，可以自由進(jìn)食去卵清蛋白（包括雞蛋）的飼料和水，常規(guī)飼養(yǎng)于云南中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心層流架。

1.2 藥物及制備

中藥丹參購自昆明福林堂藥業(yè)有限公司，使用前水煎3次后濃縮成含生藥1 g/mL的混懸液。

1.3 試劑及儀器設(shè)備

卵清蛋白（OVA）、氫氧化鋁凝膠（美國Sigma公司）；大鼠MMP-9 ELISA試劑盒（蘇州卡爾文生物科技有限公司）。

大鼠霧化箱（有機(jī)玻璃，自制，大?。?5 cm×35 cm× 20 cm）；壓縮霧化器（PARI BOYN08，德國百瑞有限公司）；電子天平（AR124CN型，美國奧豪斯）；離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、組織烘/攤片機(jī)（德國Leica）；顯微鏡（日本Olympus）；酶標(biāo)儀（美國分子儀器公司）；超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）等。

1.4 氣道重塑模型的建立

哮喘大鼠氣道重塑模型是在哮喘大鼠模型的基礎(chǔ)上延長激發(fā)時(shí)間而建立的[6-7]。哮喘模型組、丹參干預(yù)組第1天和第14天腹腔注射OVA-氫氧化鋁混懸液2 mL致敏（OVA 1 mg，氫氧化鋁100 mg，加生理鹽水至2 mL），于實(shí)驗(yàn)第21天起將大鼠置于密閉容器內(nèi)，予2%OVA生理鹽水霧化激發(fā)，30 min/次，隔天1次，哮喘2周組及丹參2周組，哮喘4周組及丹參4周組，哮喘8周組及丹參8周組持續(xù)時(shí)間分別為2、4、8周，正常對照組用生理鹽水代替OVA致敏和激發(fā)。實(shí)驗(yàn)中觀察大鼠反應(yīng)，出現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促深快、腹肌抽搐、煩躁嗆咳及點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)等癥狀表明建立哮喘模型成功[8-10]。

1.5 藥物干預(yù)試驗(yàn)

每次用藥前丹參水煎冷卻備用。每次激發(fā)前30 min對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行腹腔注射給藥：正常對照組和哮喘模型組注射無菌蒸餾水，丹參干預(yù)組注射丹參水煎劑。注射劑量根據(jù)成人（60 kg）臨床一日用藥量按動(dòng)物體表面積等效劑量換算出大鼠（200 g）等效用藥量。

1.6 取材及檢測方法

1.6.1 大鼠肺組織病理檢測各組大鼠末次激發(fā)后24 h，打開胸腔取下左肺組織，中性甲醛固定，石蠟包埋后切片，蘇木精-伊紅（HE）染色光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)支氣管、血管及肺泡的病理改變。

1.6.2 大鼠肺組織MMP-9檢測取各組大鼠右肺組織500 mg，加入生理鹽水1 mL，組織勻漿器充分研磨，離心取上清0.1 mL，加生理鹽水至1 mL，充分混勻后，再次離心后取上清液備測。采用ELISA檢測試劑盒測定上清液MMP-9含量，操作步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行，通過標(biāo)準(zhǔn)品吸光度（A）值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算各樣本MMP-9含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠支氣管肺組織病理學(xué)改變

正常對照組：大鼠肺組織未見炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管管腔規(guī)則，氣道黏膜上皮及肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔窄，氣道平滑肌薄，肺泡腔透亮，無上皮脫落損傷，黏膜無水腫（圖1A）。哮喘模型組：2周組支氣管可見黏液栓，氣道有損傷，肺泡間隔不同程度增寬，部分?jǐn)嗔眩瑲夤芘c血管周圍有炎癥細(xì)胞浸潤（圖1B）；4周組可見杯狀細(xì)胞增生，基底膜增厚，肺泡間隔不同程度增寬，輕度充血水腫，氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤（圖1C）；8周組大量密集炎癥細(xì)胞浸潤，可見黏液栓，肺泡融合、不同程度斷裂，平滑肌增生（圖1D）。丹參干預(yù)組：2周組支氣管較規(guī)則，炎癥細(xì)胞浸潤減少（圖1E）；4周組增生細(xì)胞減少，肺泡大小相似，充血、水腫減輕，少量炎癥細(xì)胞浸潤（圖1F）；8周組支氣管管壁趨于正常，上皮結(jié)構(gòu)較完整，管壁未見增厚，浸潤的炎癥細(xì)胞減少，無明顯炎性滲出（圖1G）。

2.2 各組大鼠肺組織中MMP-9含量比較

與正常對照組比較，哮喘2周組肺組織中MMP-9含量有所升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而哮喘4、8周組肺組織中MMP-9含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05、P＜0.01）；與哮喘2周組比較，丹參2周組肺組織中MMP-9含量有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而哮喘8周組肺組織中MMP-9含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與哮喘4周組比較，丹參4周組肺組織中MMP-9含量有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而哮喘8周組肺組織中MMP-9含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與哮喘8周組比較，丹參8周組肺組織中MMP-9含量顯著降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠肺組織中MMP-9含量比較（ng/mL，)

表1 各組大鼠肺組織中MMP-9含量比較（ng/mL，)

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與哮喘2周組比較，△P＜0.05；與哮喘4周組比較，▲P＜0.05；與哮喘8周組比較，▽P＜0.01；MMP-9：基質(zhì)金屬蛋白酶-9

組別只數(shù)MMP-9正常對照組哮喘2周組哮喘4周組哮喘8周組丹參2周組丹參4周組丹參8周組10 9 7 7 8 7 7 1.99±0.29 2.29±0.51 2.43±0.40*3.01±0.31**△▲1.93±0.30 2.06±0.49 2.10±0.20▽

3 討論

近年來有效改善氣道重塑成為哮喘防治的新方向，國內(nèi)關(guān)于哮喘氣道重塑研究成為哮喘研究中的亮點(diǎn)。西藥以糖皮質(zhì)激素的研究為主，但糖皮質(zhì)激素能否抑制哮喘氣道重塑仍存在爭議[11-12]。此外，糖皮質(zhì)激素的眾多副作用一直使其極富爭議性。

中醫(yī)藥注重“整體調(diào)節(jié)，扶正固本，平衡陰陽”的總原則，對哮喘氣道重塑有良好的治療效果[13]。大多數(shù)中醫(yī)醫(yī)家都認(rèn)同，在不同證型的纖維化中，瘀血是重要病理產(chǎn)物。因此，活血化瘀是治療器官纖維化的大法[14]。王文建等[6]、張力江等[15]均證實(shí)川芎嗪、藍(lán)玉簪顆粒（主要成分為藏藥藍(lán)玉簪龍膽和三七總皂苷）等活血化瘀中藥可以有效減輕哮喘氣道重塑。丹參具有抗纖維化、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等作用，可通過這些作用多靶點(diǎn)、多層次干預(yù)氣道重塑的形成，有效地改善或阻斷哮喘大鼠氣道重塑。其機(jī)制可能如下：①活血化瘀，對抗氧自由基，改善微循環(huán)，有利于及時(shí)清除氣道上的炎性因子及免疫復(fù)合物；②調(diào)節(jié)免疫功能，既可促進(jìn)單核-巨噬細(xì)胞的吞噬作用，加快清除免疫復(fù)合物，又可通過抑制相應(yīng)器官組織中炎性因子的含量抑制免疫反應(yīng)對靶器官的損傷；③抑制成纖維細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡，減少膠原合成和分泌[16]；④抑制血小板聚集與活化[17]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)丹參對抗哮喘氣道炎癥及氣道重塑均有一定作用，它能減輕哮喘氣道重塑已形成的各種結(jié)構(gòu)改變，包括氣道壁上皮層增厚、上皮下膠原沉積及平滑肌層增厚及炎癥細(xì)胞浸潤。

MMP-9是特異性降解ECM的鋅依賴性蛋白酶家族，在氣道重塑中起重要作用。作為與哮喘氣道重塑關(guān)系最為密切的基質(zhì)金屬蛋白酶，MMP-9主要負(fù)責(zé)降解ECM，在哮喘狀態(tài)下，MMP-9的過度表達(dá)不僅能導(dǎo)致ECM結(jié)構(gòu)重塑，而且能誘導(dǎo)嗜酸粒細(xì)胞遷移并影響氣道平滑肌細(xì)胞增殖與遷移，進(jìn)而誘發(fā)哮喘氣道重塑，因此抑制MMP-9表達(dá)已被認(rèn)為是改善哮喘氣道重塑的重要機(jī)制之一[18]。本實(shí)驗(yàn)提示，丹參可以降低哮喘氣道重塑大鼠肺組織中MMP-9的表達(dá)，起到改善哮喘氣道重塑的作用。從藥物作用時(shí)間來看，8周干預(yù)效果為佳。

同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在哮喘大鼠模型（以O(shè)VA-氫氧化鋁混懸液致敏激發(fā)大鼠）的基礎(chǔ)上延長激發(fā)時(shí)間可以建立哮喘氣道重塑模型，持續(xù)作用2周以上大鼠即可出現(xiàn)不同程度氣道重塑的表現(xiàn)，隨激發(fā)時(shí)間延長，氣道重塑越明顯，從效果來看，造模持續(xù)作用時(shí)間以8周為佳。

[1]Makinde T，Murphy RF，Agrawal DK.The regulatory role of TGF-beta in airway remodeling in asthma[J].Immunol Cell Biol，2007，85（5）：348-356.

[2]劉慧，開金龍.丹參的現(xiàn)代研究進(jìn)展[J].甘肅中醫(yī)，2010，23（2）：70-72.

[3]Mehra D，Sternberg DI.Altered lymphocyte trafficking and diminished airway reactivity in transgenic mice expressing human MMP-9 in a mouse model of asthma[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2010，298（2）：189-196.

[4]Tanaka H，Miyazaki N，Oashi K，et al.Sputum matrix metalloproteinase-9：tissue inhibitor of metalloproteinase-1 ratio in acute asthma[J].J Allergy Clin Immunol，2000，105（5）：900-905.

[5]徐方艷，凌杰.布地奈德霧化吸入對哮喘患兒血清基質(zhì)金屬蛋白酶-2、9水平的影響及療效觀察[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2013，51（15）：65-67.

[6]王文建，楊莉，王西華，等.川芎嗪對大鼠支氣管哮喘模型氣道重塑的影響及機(jī)制[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2004，27（12）：833-836.

[7]陳慧君，戴元榮.Caveolin-1和p42/p44MAPK在哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖中的作用[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2013，51（25）：1-3，6.

[8]Eynott PR，Nath P，Leung SY，et al.Allergen-induced inflammuition and airway epithelial and smooth muscle cell proliferation：role of Jun N-terminal kinase[J].Br J Pharmmeol，2003，140（8）：1373-1380.

[9]鞏雪芳，薄建萍.堿性成纖維細(xì)胞生長因子在大鼠哮喘氣道重塑模型中的表達(dá)及地塞米松的干預(yù)作用[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2010，16（4）：142-144.

[10]李陳，況九龍.基質(zhì)金屬蛋白酶-9在哮喘大鼠氣道重構(gòu)中的作用及丹參干預(yù)的影響[J].江西醫(yī)藥，2010，45（2）：104-106.

[11]楊敏，王金山.早期吸入糖皮質(zhì)激素對哮喘大鼠氣道重塑及NF-κB、TGF-β1表達(dá)的影響[J].天津醫(yī)藥，2008，36（7）：530-532.

[12]趙熒，李玉梅.布地奈德對哮喘大鼠氣道重塑及支氣管肺泡灌洗液、肺組織中轉(zhuǎn)化生長因子-β1表達(dá)的影響[J].臨床兒科雜志，2010，28（2）：173-177.

[13]許朝霞，王憶勤，燕海霞，等.中醫(yī)藥干預(yù)支氣管哮喘氣道重建的研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)雜志，2011，38（9）：1769-1771.

[14]牛建昭，賁長恩.器官纖維化基礎(chǔ)及中醫(yī)藥防治[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：11.

[15]張力江，陳衛(wèi)強(qiáng).中藥藍(lán)玉簪顆粒對慢性哮喘小鼠氣道重建的影響及機(jī)制[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28（21）：1933-1936.

[16]鄒萍，盛薇，李惠林，等.丹參注射液誘導(dǎo)口腔黏膜下纖維性變成纖維細(xì)胞凋亡的試驗(yàn)研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2007，25（12）：2566.

[17]陳輝，邵躍斌，黎慶梅，等.燈盞花、丹參液在體外對血小板活化抑制作用的研究[J].國際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào)，2009，15（21）：1-5.

[18]Piiril a P，Lauhio A，Majuri ML，et al.Matrix metalloproteinases-7，-8，-9 and TIMP-1 in the follow-up of diisocyanate-induced asthma[J].Allergy，2010，65（1）：61-68.

Effects of Salvia Miltiorrhiza on airway remodeling and MMP-9 in rats with asthma

LI Yuqing ZHAO Wenjuan XIA Yonghui LI Yan CHEN Jing
Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Yunnan Province,Kunming 650500,China

ObjectiveTo study the effects of Salvia Miltiorrhiza on airway remodeling and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9)in rats with asthma.MethodsSeventy SPF male adult SD rats were randomly divided into normal control group,asthma model group(asthmatic two-weeks group,asthmatic four-weeks group and asthmatic eight-weeks group), Salvia Miltiorrhiza intervention group(Salvia Miltiorrhiza two-weeks group,Salvia Miltiorrhiza four-weeks group and Salvia Miltiorrhiza eight-weeks group).Ovalbumin(OVA)-hydroxide suspension was applied to stimulate the remodeling of asthmatic airway in rats,for 2,4,8 weeks respectively.The pathological changes on the lung tissue of asthmatic rats were observed,ELISA was used to detect the level of MMP-9 in lung tissue of rats.ResultsThe results indicated that Salvia Miltiorrhiza improved infiltration of airways inflammatory cells and thickening of bronchial smooth muscle cells in asthmatic rats.Compared with normal control group[(1.99±0.29)ng/mL],the content of MMP-9 in lung tissue of asthmatic four weeks-group[(2.43±0.40)ng/mL]and asthmatic eight-weeks group[(3.01±0.31)ng/mL]increased(P＜0.05,P＜0.01);compared with asthmatic two-weeks group[(2.29±0.51)ng/mL],asthmatic four-weeks group[(2.43± 0.40)ng/mL],the content of MMP-9 in lung tissue of asthmatic eight-weeks group[(3.01±0.31)ng/mL]increased(P＜0.05);compared with asthmatic eight weeks-group[(3.01±0.31)ng/mL],the content of MMP-9 in lung tissue of Salvia Miltiorrhiza eight-weeks group[(2.10±0.20)ng/mL]decreased significantly(P＜0.01).ConclusionSalvia Miltiorrhiza can inhibit the secretion of MMP-9 in lung tissue of asthmatic rats,improve the state of airway remodeling in asthmatic rats.

Salvia Miltiorrhiza;Bronchial asthma;Airway remodeling;Matrix metalloproteinases-9

R965

A

1673-7210（2015）07（b）-0012-04

2015-04-15本文編輯：李亞聰）

云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目（2013Y241）；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（2014FZ088）。

李玉卿（1979.4-），女，天津人，昆明醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：中醫(yī)藥在生物學(xué)中的應(yīng)用；專業(yè)擅長：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。

陳靜（1978.8-），女，上海人，碩士；研究方向：病原生物學(xué)與免疫學(xué)；專業(yè)擅長：病原生物學(xué)與免疫學(xué)科研及教學(xué)。