郭大城，張可可，董貴彬，張旭萍，劉 慧，朱大恒，席 宇*

1 河南省疾病預防與控制中心，鄭州 450016;2鄭州大學生命科學學院，鄭州 450001

類胡蘿卜素(carotenoids)是萜類化合物的羥基化衍生物，在生物體內(nèi)具有抗炎、增強機體免疫力、防治腫瘤和治療光敏性疾病等作用［1］，因此在食品、化妝品、醫(yī)藥和飼料添加劑等行業(yè)有廣泛的應(yīng)用［2-4］。利用非糧廉價底物通過微生物的合成作用生產(chǎn)類胡蘿卜素，降低生產(chǎn)成本是目前類胡蘿卜素生產(chǎn)的一個研究熱點［5］。煙梗是卷煙工業(yè)的一種廢棄物，約占煙葉總重的20%～30%［6］，大量的煙梗被廢棄，造成資源浪費和環(huán)境污染［7，8］。煙梗中含有大量的可溶性糖類和氮類物質(zhì)［9］，因此對其進行資源化利用是非常重要的。目前WTS 多用來提取煙堿、果膠、茄尼醇［10-12］，然而利用酵母發(fā)酵WTS生產(chǎn)類胡蘿卜素尚未見報道。本實驗以一株分離的富含類胡蘿卜素的深紅酵母(Rhodotorula rubra)JLC為出發(fā)菌株，以WTS 為主要基質(zhì)，對影響菌株JLC發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素的因素利用PB 設(shè)計法進行考察，旨在為WTS 的資源化利用和天然類胡蘿卜素的開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

WTS 由河南天昌國際煙草有限公司提供，長度為0.2～5.0 cm，直徑為0.15～0.50 cm。酵母粉和蛋白胨購自英國OXOID 公司，瓊脂粉購自美國Sanland 公司，其余實驗用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 菌株及培養(yǎng)基

深紅酵母JLC 保藏于鄭州大學生命科學學院，其類胡蘿卜素最大吸收波長485 nm。菌種保藏和種子液制備均采用煙梗提取液(tobacco stem extraction，TSE)培養(yǎng)基［13］，其中固體培養(yǎng)基瓊脂含量為2.0%。

1.3 儀器

生化培養(yǎng)箱(MJX-70，上海和呈儀器制造有限公司);電熱鼓風干燥箱(101，北京中興偉業(yè)儀器有限公司);立式高壓滅菌器(YXQ-LS-30SII，上海博迅實業(yè)有限公司);雙人雙面凈化工作臺(SW-CJ-2F，蘇州凈化設(shè)備有限公司);紫外可見分光光度計(UV-2450，日本島津);低溫高速離心機(Avanti J-25，Beckman coulter);連續(xù)流動分析儀(AA3，德國布朗盧比公司);恒溫數(shù)顯水浴鍋(XTMD-8222，上海精宏實驗設(shè)備有限公司);電子分析天平(BS223S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 煙梗預處理及成分分析

WTS 于60 ℃干燥箱中干燥2 h，去除較粗和較長煙梗后過16 目標準篩除塵備用。處理后WTS 采用連續(xù)流動分析儀進行主要成分分析。

1.4.2 種子液制備

從菌種斜面挑取一環(huán)培養(yǎng)物接種到含有80 mL種子培養(yǎng)液的250 mL 三角瓶中，置于恒溫搖床30℃和180 rpm 條件下培養(yǎng)36 h，獲得的培養(yǎng)物作為固態(tài)發(fā)酵的種子液。

1.4.3 固態(tài)發(fā)酵方法

分別稱取一定量的WTS 置于250 mL 三角瓶中，按照1.4.4 實驗設(shè)計加入相應(yīng)量的添加物，以WTS 與水1∶3 的比例加入自來水后混勻室溫浸泡10 h，121 ℃滅菌20 min。冷卻后無菌操作將種子液以不同的接種量接種到上述三角瓶中，混合均勻，恒溫30 ℃靜置培養(yǎng)，每24 h 輕搖1 次。

1.4.4 PB 設(shè)計實驗方案

PB 設(shè)計可利用最少的實驗次數(shù)，從考查的眾多因素中快速篩選出主要影響效應(yīng)［3］。根據(jù)單因子實驗結(jié)果，PB 設(shè)計(N=12)對影響WTS 發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素的10 種因素進行了評估，10 種因素的編碼、單位及水平見表1。

表1 PB 設(shè)計試驗所選因子、水平及編碼Table 1 The two levels of variables and codes used in the Plackett-Burman design

注:①指250 mL 三角瓶中裝載WTS 的質(zhì)量;②指種子液與固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)比例(v/w)。Note:①The quantity of WTS in a 250 mL Erlenmeyer flask;②The ratio of the seed broth to fermentation substrates(v/w).

1.5 分析方法

1.5.1 酵母生物量分離及測定

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)一定時間后，向含發(fā)酵物的三角瓶中加入適量生理鹽水，雙層紗布過濾獲得菌體濾液后定容。20 mL 菌體濾液8 000 rpm 離心10 min，棄除上清，收集菌體，無菌水洗滌2 次，105 ℃烘至恒重，稱重并計算生物量［14］。

1.5.2 菌體類胡蘿卜素的提取及含量測定

一定量的濕菌體經(jīng)鹽酸-熱處理破壁后，用丙酮抽提類胡蘿卜素。類胡蘿卜素的提取參照文獻［15］進行。用紫外可見分光光度計測定色素提取液485 nm 處吸光度，按下式計算類胡蘿卜素含量:

式中，Aλmax為色素最大吸收波長處的吸光度;D為測定試樣的稀釋倍數(shù);V 為提取色素所用溶劑量(mL);W 為菌體重量(g);0.16 為類胡蘿卜素的消光系數(shù)。根據(jù)菌體細胞類胡蘿卜素含量計算固態(tài)發(fā)酵物中類胡蘿卜素的產(chǎn)量。

1.5.3 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.6 統(tǒng)計分析軟件進行處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 WTS 成分分析

WTS 中含有大量可溶性糖、煙堿等水溶性物質(zhì)，其主要成分如表2。因此，經(jīng)水浸泡后WTS 可作為一種廉價的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)。發(fā)酵基質(zhì)顆粒大小在固態(tài)發(fā)酵過程中起重要的作用，小顆粒基質(zhì)能夠提供更大的微生物作用表面，因此固態(tài)發(fā)酵中多采用小顆?；|(zhì)［16］。采用小顆粒基質(zhì)，發(fā)酵后酵母細胞很難與基質(zhì)顆粒分離。本實驗中采用大顆粒的WTS 進行發(fā)酵，發(fā)酵后通過簡單的過濾即可獲得高純度的酵母細胞，因此有利于規(guī)模化生產(chǎn)過程中類胡蘿卜素及其它高附加值產(chǎn)物的分離和提取。

表2 預處理煙梗的成分分析(g/L)Table 2 The main compositions of WTS used in this study(g/L)

2.2 PB 設(shè)計試驗方案及其結(jié)果

PB 設(shè)計實驗中，生物量、色素含量及色素產(chǎn)量的響應(yīng)值見表3。從表3 可看出:對生物量而言，最小的響應(yīng)值為51.30 mg/g，最大響應(yīng)值為89.45 mg/g;類胡蘿卜素的最小和最大響應(yīng)值分別為8.91 μg/g 和21.54 μg/g。色素含量在試驗過程中變化也較大，第6 次試驗中，以煙梗為唯一基質(zhì)，色素含量為173.68 μg/g，其它11 次試驗中色素含量均不同程度升高，表明添加因子對JLC 色素的累積有正效應(yīng)?？偟膩碚f，在12 次試驗中生物量、色素含量和色素產(chǎn)量變化均較大，表明在PB 設(shè)計中所選因子對響應(yīng)值影響較大。

表3 PB 設(shè)計試驗方案及結(jié)果Table 3 Plackett-Burman design matrix with biomass and carotenoid production

2.3 PB 設(shè)計試驗的方差分析

Prob＞F 值的大小能夠表示模型及各個因子的顯著性情況，當Prob＞F 值小于0.05，表明有顯著影響，當Prob＞F 值小于0.01，表明有極顯著影響［19］。對PB 設(shè)計試驗結(jié)果進行方差分析見表4，結(jié)果表明，實驗?zāi)Ｐ瓦_到顯著水平。在實驗選擇的10 個因素中，蛋白胨、葡萄糖和NaNO3對實驗?zāi)Ｐ陀绊懖伙@著，而蔗糖、酵母粉、(NH4)2SO4、裝載量和培養(yǎng)時間對實驗?zāi)Ｐ陀绊戯@著。

表4 PB 設(shè)計試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman design experimental results

注:①Prob＞F 小于0.05，表明模型或參數(shù)有顯著影響;Prob＞F 小于0.01，表明模型或參數(shù)有極顯著影響。Note:①Prob＞F less than 0.05，indicates that the model or parameters have a significant effect;②Prob＞F less than 0.01，indicates that the model or parameter has an extremely significant effect.

2.4 供試因子對PB 設(shè)計試驗?zāi)Ｐ偷呢暙I度

貢獻度(% contribution)指模型中的某因子的平方和占模型中各因子平方和總和的百分數(shù)，其值越大表明該因子對實驗結(jié)果的影響越大［17］。供試因子對類胡蘿卜素產(chǎn)量的貢獻度見表5，結(jié)果表明，裝載量、培養(yǎng)時間和酵母粉對模型貢獻度相對較大，而蛋白胨、(NH4)2SO4、蔗糖等因素對模型貢獻度相對較小。

根據(jù)因子的貢獻度和Prob＞F 值綜合考慮，培養(yǎng)時間、裝載量和酵母粉是影響JLC 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)類胡蘿卜的重要因子，因此在下一步的放大發(fā)酵研究中對這3 個因素進行優(yōu)化，有望進一步提高類胡蘿卜產(chǎn)量。

表5 PB 設(shè)計試驗中供試因子對類胡蘿卜素產(chǎn)量的貢獻度(%)Table 5 The contribution of the tested variables to carotenoids production in Plackett-Burman design(%)

3 結(jié)論

深紅酵母JLC 固態(tài)發(fā)酵WTS，發(fā)酵后簡單過濾即可獲得高純度酵母細胞，有利于類胡蘿卜素的提取，同時也有利于其它高附加值酵母成分的提取。裝載量、培養(yǎng)時間和酵母粉是影響類胡蘿卜素產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。因此，以WTS 為主要基質(zhì)，添加適量酵母粉，通過優(yōu)化裝載量和培養(yǎng)時間固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素，既可資源化利用WTS，又可獲得天然類胡蘿卜素。通過PB 實驗，菌株JLC 類胡蘿卜素的最大產(chǎn)量為21.54 μg/g，進一步優(yōu)化有望提高類胡蘿卜素產(chǎn)量。

1 Liu XJ(劉曉娟)，Duan SS(段舜山)，Li AF(李愛芬).Research advances on the production of carotenoids by microalgae.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2007，2:333-337.

2 Frengova GI，Beshkova DM.Carotenoids from Rhodotorula and Phaffia:yeasts of biotechnological importance.J Ind Microbiol Biotechnol，2009，36:163-180.

3 Elsanhoty RM，Al-Turki I，Ramadan MF.Screening of medium components by Plackett-Burman design for carotenoid production using date(Phoenix dactylifera)wastes.Ind Crops Prod，2012，36:313-320.

4 Huang YC(黃延春)，Li YX(李云霞).Research progress on carotenoids in red Pepper.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2013，4:562-565.

5 Frengova G，Simova E，Beshkova D.Use of whey ultrafiltrate as a substrate for production of carotenoids by the yeast Rhodotorula rubra.Appl Biochem Biotechnol，2004，112:133-141.

6 Li W，Zhanq LB，Peng JH，et al.Tobacco stems as a low cost adsorbent for the removal of Pb(II)from wastewater:Equilibrium and kinetic studies.Ind Crops Prod，2008，28:294-302.

7 Zhang KH，Zhang K，Cao Y，et al.Co-combustion characteristics and blending optimization of tobacco stem and high-sulfurbituminous coal based on thermogravimetric and mass spectrometry analyses.Bioresour Technol，2013，131:325-332.

8 Li W，Zhang LB，Peng JH，et al.Preparation of high surface area activated carbons from tobacco stems with K2CO3activation using microwave radiation.Ind Crops Prod，2008，27:341-347.

9 Sung YJ，Seo YB.Thermogravimetric study on stem biomass of Nicotiana tabacum.Thermochim Acta，2009，486:1-4.

10 Dong ZN(董占能)，Bai JC(白聚川)，Zhang HD(張皓東).Comprehensive utilization of tobacco waste.Chin Tob Sci(中國煙草科學)，2008，1:39-42.

11 Xu YJ(徐永建)，Zhao R(趙睿)，Tan HF(譚海風).Research progress on the comprehensive utilization of tobacco waste.J Shanxi Univ Sci Technol(陜西科技大學學報)，2012，05:16-21.

12 Zi WH，Peng JH，Zhang XL，et al.Optimization of waste tobacco stem expansion by microwave radiation for biomass material using response surface methodology.J Taiwan Inst Chem Eng，2013，44:678-685.

13 Ji YL(吉彥龍)，Xi Y(席宇)，Li MR(李敏睿)，et al.Optimization of fermentation conditions for producing Rhodotorula rubra JLC with waste tobacco stems.Tob Sci Technol(煙草科技)，2013，1:77-80.

14 Li X，Jia OY，Xu Y，et al.Optimization of culture conditions for production of yeast biomass using bamboo wastewater byresponse surface methodology.Bioresour Technol，2009，100:3613-3617.

15 Wang SL(王歲樓).The extraction of carotenoids from Rhodotorula.Shanxi Food Ind(山西食品工業(yè))，2001，(1):3.

16 Krishna C.Solid-state fermentation systems-an overview.Crit Rev Biotechnol，2005，25(1-2):1-30.

17 Dai WL(代文亮)，Cheng L(程龍)，Tao WY(陶文沂).Application of response surface methodology in optimization of precursors for Taxol production by Fusarium mairei K178.Chin Technol(中國生物工程雜志)，2007，11:66-72.