陳麗君 王 娟 李 佳 王 建

1.陜西省渭南市富平縣醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西富平711700；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安710004；3.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安710032

漢黃芩素對(duì)卵巢癌HO-8910細(xì)胞增殖及凋亡的影響

陳麗君1王 娟2李 佳3王 建3

1.陜西省渭南市富平縣醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西富平711700；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安710004；3.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安710032

目的探討漢黃芩素對(duì)人卵巢癌HO-8910細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并分析可能的作用機(jī)制。方法采用不同濃度（0、20、50、80、100、130 μg/mL）的漢黃芩素處理人卵巢癌HO-8910細(xì)胞，48 h后分別用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力的變化，AnnexinⅤ/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化，Western blotting分析p21、cyclin B1、p53和Bax蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果隨著處理濃度的增加，漢黃芩素劑量依賴性地抑制人卵巢癌HO-8910細(xì)胞的增殖（P＜0.05），同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞大量凋亡。進(jìn)一步分析證實(shí)，漢黃芩素能夠劑量依賴性地下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin B1的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)p21的表達(dá)（P＜0.05），提示漢黃芩素可通過(guò)抑制細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程來(lái)抑制細(xì)胞的增殖。此外，漢黃芩素還能顯著誘導(dǎo)p53通路的活化及其下游促凋亡分子Bax的表達(dá)（P＜0.05）；而用p53通路抑制劑PFT-α預(yù)處理能夠顯著性降低漢黃芩素誘導(dǎo)的促卵巢癌細(xì)胞的凋亡效應(yīng)（P＜0.05）。結(jié)論漢黃芩素能通過(guò)抑制細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程及調(diào)控p53促凋亡通路的活化來(lái)抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，同時(shí)顯著誘導(dǎo)細(xì)胞大量凋亡，提示漢黃芩素可能具有一定的抗卵巢癌活性，從而為進(jìn)一步探討其作為臨床治療卵巢癌的潛在藥物奠定理論基礎(chǔ)。

卵巢癌；漢黃芩素；增殖；凋亡；細(xì)胞周期

漢黃芩素（wogonin，別名5，7-二羥基-8-甲氧基-2-苯基-4H-1-苯并呋喃-4-酮）是從中藥黃芩根及半枝蓮中提取的活性物質(zhì)，具有抗病毒、抗菌、保護(hù)血管、降血脂及利膽、解痙等生物活性［1-4］。近年來(lái)，漢黃芩素在抗腫瘤中的作用得到廣泛關(guān)注。研究表明，漢黃芩素能夠有效地抑制多種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的大量凋亡［4-5］。但是，漢黃芩素對(duì)卵巢癌細(xì)胞的影響及其機(jī)制尚不清楚。因此，本研究體外觀察漢黃芩素對(duì)卵巢癌細(xì)胞HO-891增殖及凋亡的影響，并探討相關(guān)的作用機(jī)制，從而為進(jìn)一步探討其在臨床中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人卵巢癌HO-8910細(xì)胞株購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；胎牛血清和MTT購(gòu)自華美生物工程有限公司；p53抑制劑PFT-α購(gòu)自Calbiochem公司；AnnexinⅤ/PI雙染凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD公司；兔抗人p53、p21和Bax多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；兔抗人cyclin B1抗體和小鼠抗兔-HRP標(biāo)記抗體均購(gòu)自Cell Signaling公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理將人卵巢癌HO-8910細(xì)胞株置于含10%滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。每1～2天換液1次，2～3 d傳代1次。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HO-8910細(xì)胞接種于24孔板，每孔200 μL，含1×105個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞中分別加入20、50、80、100、130 μg/mL的漢黃芩素，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，空白處理為空白對(duì)照組。用100 μg/mL的漢黃芩素處理細(xì)胞，48 h后用25 μmol/L的p53抑制劑PFT-α處理細(xì)胞，2 h后進(jìn)行細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力不同濃度漢黃芩素處理細(xì)胞48 h后，向每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清；加入150 μL DMSO（二甲基亞砜），置于搖床上低速振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶物；酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm處OD值。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組A490值-空白調(diào)零組A490值）/（空白對(duì)照組A490值-空白調(diào)零組A450值）×100%

1.2.3 AnnexinⅤ/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡收集預(yù)處理細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌3次后加入1 mL 1×AnnexinⅤ結(jié)合緩沖液，4℃1000 r/min離心10 min去上清；加入200 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，隨后分別加入10 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL PI（5 μg/mL）進(jìn)行標(biāo)記，輕輕混勻；避光孵育30 min，將細(xì)胞置于流式細(xì)胞儀中檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。具體操作按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.4 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)用0.05%胰蛋白酶消化細(xì)胞，PBS洗滌3次；200 μL預(yù)冷的裂解液裂解細(xì)胞，冰上放置20 min，4℃12 000 r/min離心10 min，取上清。樣品煮沸處理后，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳；采用半干轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉，按照常規(guī)的方法加入兔抗人p21、cyclin B1、p53及Bax一抗和HRP標(biāo)記的小鼠抗兔的二抗。ECL底物顯色，觀察p21、cyclin B1、p53及Bax的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；兩組間比較采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 漢黃芩素對(duì)HO-8910細(xì)胞增殖的影響

MTT法分析顯示，與空白對(duì)照組相比，漢黃芩素對(duì)卵巢癌細(xì)胞HO-8910的生長(zhǎng)具有抑制作用，且隨著劑量的加大，細(xì)胞的生長(zhǎng)速率明顯降低，其中，80、100、130 μg/mL漢黃芩素作用48 h時(shí)，細(xì)胞的存活率分別為（61.4±4.2）%、（55.8±5.8）%、（42.7±6.7）%，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 漢黃芩素對(duì)HO-8910細(xì)胞增殖的影響

2.2 漢黃芩素對(duì)HO-8910細(xì)胞凋亡的影響

流式分析顯示，與空白對(duì)照組相比，漢黃芩素處理組中Q2和Q4區(qū)熒光強(qiáng)度不斷增加，表明漢黃芩素能夠誘導(dǎo)HO-8910細(xì)胞大量凋亡（圖2A）。定量分析表明，用50、100 μg/mL漢黃芩素處理后，細(xì)胞的凋亡率分別為（27.2±2.5）%和（45.1±3.8）%，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）（圖2B），提示漢黃芩素劑量依賴性地誘導(dǎo)HO-8910細(xì)胞的凋亡。

2.3 漢黃芩素對(duì)HO-8910細(xì)胞周期蛋白cyclin B1和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子p21表達(dá)的影響

Western blotting分析表明，與空白對(duì)照組相比，漢黃芩素劑量依賴性地上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子p21的表達(dá)，同時(shí)細(xì)胞周期蛋白cyclin B1的表達(dá)明顯下調(diào)（圖3A）。定量分析證實(shí)，分別用50 μg/mL和100 μg/mL漢黃芩素處理48 h后，p21的表達(dá)水平分別上調(diào)至空白對(duì)照組的2.50倍和3.82倍（P＜0.01）；而cyclin B1的表達(dá)水平分別下降至空白對(duì)照組的0.78倍和0.52倍（P＜0.05）（圖3B），表明漢黃芩素可劑量依賴性地抑制HO-8910細(xì)胞DNA的合成。

2.4 漢黃芩素對(duì)p53通路的影響

圖2 漢黃芩素對(duì)HO-8910細(xì)胞凋亡的影響

圖3 Western blotting分析p21和cyclin B1蛋白表達(dá)水平

結(jié)果證實(shí)，100 μg/mL漢黃芩素處理48 h后，細(xì)胞中p53表達(dá)水平明顯增高，同時(shí)其下游促凋亡分子Bax蛋白的表達(dá)水平顯著性上調(diào)（圖4A）；定量分析表明，與空白對(duì)照組相比，100 μg/mL漢黃芩素處理后p53和Bax的表達(dá)水平分別增加了3.8和2.7倍（P＜0.05），提示漢黃芩素能夠誘導(dǎo)HO-8910細(xì)胞中p53通路的活化（圖4B）。進(jìn)一步機(jī)制分析表明，25 μmol/L的p53抑制劑PFT-α處理2 h后，漢黃芩素誘導(dǎo)的HO-8910細(xì)胞的凋亡率明顯下降，與漢黃芩素單獨(dú)處理組相比，下降了100%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4C）。

圖4 漢黃芩素對(duì)p53通路的影響

3 討論

卵巢癌是一種致死率最高的常見(jiàn)惡性婦科腫瘤，具有較高的增殖及遷移速率［6-8］。傳統(tǒng)的手術(shù)、化療、放療及綜合治療等方法雖然在卵巢癌患者的治療中得到廣泛應(yīng)用，但并不能提高晚期卵巢癌患者預(yù)后5年生存率，且伴隨有化療耐藥及嚴(yán)重的藥物毒副作用等缺點(diǎn)［9］。因此，尋求新型高效、低毒抗癌藥物成為卵巢癌治療研究的熱點(diǎn)之一。

黃酮類化合物具有廣泛的抗炎、抗病毒、解熱等功效，越來(lái)越多的研究證實(shí)，黃酮類化合物具有潛在的抗腫瘤特性［10-12］。漢黃芩素是一種典型的黃酮類化合物，具有來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉、無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，可發(fā)揮抗感染、抗血栓和抑制腫瘤等功能［13-15］。研究證實(shí)，漢黃芩素不僅能夠制黑素瘤細(xì)胞的侵襲，還可通過(guò)調(diào)控多種信號(hào)通路發(fā)揮抗肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的功效［5，16］。但是，漢黃芩素對(duì)卵巢癌細(xì)胞生理特性的影響及其機(jī)制尚不清楚。

本研究證實(shí)，漢黃芩素可劑量依賴性地抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞大量凋亡。多項(xiàng)研究證實(shí)，許多抗癌藥可通過(guò)阻斷癌細(xì)胞的細(xì)胞周期來(lái)抑制細(xì)胞的增殖進(jìn)程，進(jìn)而發(fā)揮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效應(yīng)［17-20］。已知細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK能夠調(diào)控DNA的復(fù)制及有絲分裂過(guò)程，而p21作為CDK1的抑制劑，能夠阻止細(xì)胞向G2/M期的過(guò)渡，抑制DNA合成。細(xì)胞周期蛋白cyclin B1能夠與CDK1結(jié)合，觸發(fā)細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程。當(dāng)用漢黃芩素處理后，細(xì)胞中p21的表達(dá)水平顯著性增加，同時(shí)cyclin B1表達(dá)水平明顯下降，表明漢黃芩素能夠通過(guò)阻斷細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程來(lái)抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。已知p53及其下游的促凋亡分子Bax在調(diào)控細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著重要作用。本研究證實(shí)，漢黃芩素處理后，卵巢癌細(xì)胞HO-8910中p53的表達(dá)水平明顯增高，同時(shí)誘導(dǎo)p53下游促凋亡分子Bax表達(dá)的上調(diào)。進(jìn)一步分析表明，阻斷p53通路后，漢黃芩素誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞凋亡率明顯下降，提示漢黃芩素可能通過(guò)p53通路的活化來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，本研究證實(shí)了漢黃芩素能夠通過(guò)抑制細(xì)胞周期進(jìn)程及促凋亡通路的活化來(lái)調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞的增殖和凋亡，從而為進(jìn)一步討論其在卵巢癌治療中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。但是，漢黃芩素如何調(diào)控細(xì)胞周期及活化p53促凋亡通路的作用機(jī)制尚不清楚，還有待于進(jìn)一步研究。

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Effect of wogonin on the proliferation and apoptosis of ovarian carcinoma HO-8910 cells

CHEN Lijun1WANG Juan2LI Jia3WANG Jian3
1.Department of Obstetrics and Gynecology,Fuping County Hospital in Weinan City,Shaanxi Province,Fuping 711700,China;2.Department of Obstetrics and Gynecology,the First Affiliated Hospital of School of Medicine of Xi'an Jiaotong University,Shaanxi Province,Xi'an710004,China;3.Department of Obstetrics and Gynecology,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Shaanxi Province,Xi'an710032,China

ObjectiveTo explore the role and underlying molecular mechanism of wogonin on the proliferation and apoptosis of ovarian carcinoma HO-8910 cells.MethodsFollowing the stimulation with various doses of wogonin(0, 20,50,80,100,130 μg/mL)for 48 h,MTT colorimetry was used to detect cell proliferation rate.Cell apoptosis was analyzed using double staining with AnnexinⅤand propidium iodide(AnnexinⅤ/PI).The expression levels of p21, cyclin B1,p53 and Bax were assessed by Western blotting.ResultsWogonin dampened ovarian carcinoma HO-8910 cell proliferation and promoted the apoptosis rates in a dose-dependent manner(P＜0.05).Moreover,wogonin dosedependently down-regulated the expression levels of cell cycle protein cyclin B1,as well as the up-regulation of p21 expression levels(P＜0.05),suggesting that wogonin might inhibit cell growth by suppressing cell cycle.Additionally, an obvious increase in p53 and its downstream Bax was observed in HO-8910 cell stimulated with wogonin statistically (P＜0.05).However,this up-regulation was dramatically attenuated when preconditioning with p53 inhibitor PFT-α(P＜0.05).ConclusionWogonin can abrogate HO-8910 cell proliferation and enhance cell apoptosis by regulating cell mitosis and apoptosis-related p53 pathway,implying as potential suppressor for ovarian cancer.Therefore,this study will support its potential targets for further development of anti-ovarian cancer therapy.

Ovarian cancer;Leptin;Proliferation; Apoptosis;Cell cycle

R737.31

A

1673-7210（2015)02（b)-0004-05

2014-11-05本文編輯：程銘）

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)81172458/H1621）。

陳麗君（1980-），女，陜西富平人，碩士；研究方向：婦科腫瘤。

王建（1962-），男，碩士，主任醫(yī)師；研究方向：婦科腫瘤。