彭耀文， 申蘭慧， 王 麗， 金 堅， 楊敏智*

(1. 江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 無錫214122;2. 江蘇省無錫藥品檢驗所，江蘇 無錫214028)

哮喘病在我國一些地區(qū)發(fā)病率較高，而中藥治療哮喘歷史悠久，療效肯定，并且具有藥源豐富、毒副作用小、價格低廉等優(yōu)點，因此一直深受患者的喜愛。但近來發(fā)現(xiàn)市場上某些所謂“強(qiáng)效、速效”治療哮喘的“純中藥制劑”，往往被非法摻入治療哮喘化學(xué)藥物成分［1］。馬來酸氯苯那敏、醋酸潑尼松均為目前臨床上治療哮喘病的常用藥物，但都具有一定的毒副作用;土霉素 (Oxytetracycline)，又名氧四環(huán)素，是四環(huán)素類廣譜抗生素，目前常用于預(yù)防和治療動物疾?。?］。近年來對中藥制劑中非法添加馬來酸氯苯那敏、醋酸潑尼松的檢測方法進(jìn)行了大量報道［3-10］;而土霉素在獸藥中非法添加有文獻(xiàn)［11-13］報道，但在中藥制劑中非法添加土霉素的檢測方法尚未報道。本實驗建立UPLC/Q-TOF-MS 法，能快速準(zhǔn)確地同時判斷中藥制劑中是否非法添加土霉素、馬來酸氯苯那敏、醋酸潑尼松，為藥品監(jiān)督管理部門對止咳平喘類中成藥及保健品的打假工作提供可靠的技術(shù)支持，保證人民用藥安全。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1290 UPLC-6530AQ-TOFMS 儀，配有柱溫箱、DAD 檢測器、大氣壓離子源ESI、MassHunter 工作站等(超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent 公司);電子天平(XS205，梅特勒公司);超聲儀(KH-300E，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);MilIipore 純水系統(tǒng)(美國Millipore 公司)。

1.2 試藥 對照品土霉素 (批號 130487-200703)、馬來酸氯苯那敏 (批號 100047-200606)、醋酸潑尼松(批號100012-200706)均購自中國食品藥品檢定研究院。樣品咳喘王膠囊(標(biāo)示為北京某研究中心，批號20140106，0.5 g/粒)、清肺膠囊(標(biāo)示為河北某制藥有限公司，批號20140207，0.5 g/粒)均來自市場抽驗樣品。甲醇為質(zhì)譜純;醋酸銨、甲酸均為分析純;水為超純水。

2 實驗方法

2.1 色譜條件 Agilent SB-C18色譜柱(2.1 mm ×100 mm，1.8 μm);流動相A 為甲醇，流動相B為10 mmol/L 醋酸銨(含0.1%甲酸)溶液;體積流量0.2 mL/min;梯度洗脫 (見表1);柱溫35 ℃;檢測波長260 nm (波長范圍190 ～400 nm);進(jìn)樣量1 μL。

2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子化正離子檢測方式(ESI+)，質(zhì)荷比范圍 m/z 50 ～700，干燥氣溫度(Gas Temp)350 ℃，干燥氣體積流量(Gas Flow)10 L/min，毛細(xì)管電壓3.5 kV，干燥氣壓力45 psi(1 psi=6.895 kPa)，碎裂電壓(Fragmentor)135 V，采用全掃描一級質(zhì)譜、選擇離子二級全掃描質(zhì)譜檢測方式。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

2.3 溶液的配制

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取土霉素對照品60.12 mg、馬來酸氯苯那敏對照品3.07 mg、醋酸潑尼松對照品3.23 mg，用甲醇溶解于50 mL 量瓶中作為混合貯備液。取5 mL 定容至20 mL，作為混合對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取10 粒樣品內(nèi)容物，混勻，研細(xì)，精密稱取約0.2 g 置100 mL 量瓶中，加入甲醇約80 mL，超聲提取20 min，放冷至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻，取上清液用0.22 μm濾膜過濾，濾液稀釋一定倍數(shù)后用于UPLC、MS、MS/MS 分析。

3 實驗結(jié)果

3.1 土霉素、馬來酸氯苯那敏、醋酸潑尼松對照品色譜及質(zhì)譜行為 采用正離子檢測方式對土霉素、馬來酸氯苯那敏、醋酸潑尼松對照品溶液進(jìn)行UPLC、MS、MS/MS 分析，優(yōu)化質(zhì)譜毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、脫溶劑氣流速、脫溶劑溫度、碰撞能量等參數(shù)。表2 給出了3 個成分的一級質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子和二級質(zhì)譜的碰撞能量，推測3 個成分質(zhì)譜裂解途徑如圖1 所示。

表2 準(zhǔn)分子離子及碎片離子Tab.2 Parent ions and daughter ions

3.2 樣品的定性檢測 將“2.3.2”項下稀釋后的樣品在相同色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行UPLC、MS、MS/MS 分析， “咳喘王膠囊”和“清肺膠囊”均檢測到與土霉素、馬來酸氯苯那敏、醋酸潑尼松3種對照品相同的保留時間峰，且紫外光譜圖也相同，相應(yīng)圖譜見圖2、圖3。結(jié)合質(zhì)譜的準(zhǔn)分子離子峰及二級碎片離子峰信息(見圖4、圖5)，可以確定所測樣品中非法添加了土霉素、馬來酸氯苯那敏、醋酸潑尼松3 種化學(xué)藥。

圖2 混合對照品、咳喘王膠囊、清肺膠囊總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatograms of mixed reference substances，Kechuanwang Capsules and Qingfei Capsules

圖3 混合對照品DAD 紫外光譜圖Fig.3 DAD UV spectra of mixed reference substances

圖4 混合對照品一級質(zhì)譜圖Fig.4 Full MS spectra of mixed reference substances

圖5 混合對照品二級質(zhì)譜圖Fig.5 Full MS2 spectra of mixed reference substances

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 線性關(guān)系考察 精密量取混合對照品的貯備液1、3、5、7、9 mL 置20 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度搖勻即得。在“2.1”色譜條件下進(jìn)行測定，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，溶液的質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到土霉素、馬來酸氯苯那敏、醋酸潑尼松的線性回歸方程分別為Y=2.742 1X-3.955 0，r=0.999 9，線性范圍為60.12 ～541.08 μg/mL;Y=3.792 0X-1.401 5，r=0.999 8，線性范圍為3.07 ～27.63 μg/mL;Y=6.225 5X - 2.498 5，r = 0.999 7，線性范圍為3.23 ～29.07 μg/mL。結(jié)果表明，線性關(guān)系良好。

3.3.2 儀器精密度試驗 取“2.3.1”項下的混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，土霉素、馬來酸氯苯那敏、醋酸潑尼松的色譜峰面積RSD 分別為0.69%、0.53%、0.62% (n =6)。結(jié)果表明，儀器的精密度良好。

3.3.3 重復(fù)性試驗 精密稱取“咳喘王膠囊”6份，按照“2.3.2”項下方法制備供試液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣，測定峰面積，外標(biāo)法計算平均含有量(mg/粒)分別為土霉素58.10、馬來酸氯苯那敏2.19、醋酸潑尼松2.25，RSD 分別為1.92%、2.04%、1.80%。結(jié)果表明，本法測定土霉素、馬來酸氯苯那敏、醋酸潑尼松含有量的重復(fù)性良好。

3.3.4 穩(wěn)定性試驗 取“2.3.2”項下的供試品溶液，分別在配制后0、1、2、4、6 h 測定，根據(jù)土霉素、馬來酸氯苯那敏、醋酸潑尼松的色譜峰面積，按外標(biāo)法計算RSD 分別為1.6%、1.3%、0.97% (n =5)。結(jié)果表明，供試品溶液在6 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.3.5 檢出限與定量限 對照品溶液逐級稀釋后測定，土霉素、馬來酸氯苯那敏、醋酸潑尼松的檢測限 (S/N = 3)分別為0.904、0.206、0.049 μg/mL;土霉素、馬來酸氯苯那敏、醋酸潑尼松的定量限(S/N =10)分別為2.715、0.412、0.146 μg/mL。

3.3.6 回收率試驗 精密稱取樣品約0.1 g，分別加入約相當(dāng)于相應(yīng)成分80%、100%、120%量的對照品3 份，按照“2.3.2”項下的方法制備供試液，在“2.1”項條件下進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，按外標(biāo)法計算。土霉素、馬來酸氯苯那敏、醋酸潑尼松的平均回收率分別為98.6%、113.9%、99.6%，RSD 分別為0.96% (n=9)、1.6% (n=9)、1.3% (n =9)。結(jié)果表明，本方法測定土霉素、馬來酸氯苯那敏、醋酸潑尼松的回收率良好。

4 樣品測定

將樣品按照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項條件下進(jìn)樣，測定咳喘王膠囊中非法添加土霉素、馬來酸氯苯那敏、醋酸潑尼松的色譜峰面積，按外標(biāo)法計算。該膠囊中非法添加土霉素、馬來酸氯苯那敏、醋酸潑尼松的平均含有量(mg/粒)分別為57.82、2.17、2.20 (n =3);清肺膠囊中非法添加土霉素、馬來酸氯苯那敏、醋酸潑尼松的平均含有量 (mg/粒)分別是47.82、2.04、2.38 (n=3)。

5 討論

5.1 流動相的優(yōu)化 本實驗考察了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-10 mmol/L 的乙酸銨(0.1% 甲酸)溶液體系為流動相對目標(biāo)化合物分離，結(jié)果表明土霉素、馬來酸氯苯那敏、醋酸潑尼松三成分雖能在乙腈-水體系中分離，但靈敏度、峰形不及甲醇-水體系;且甲醇較經(jīng)濟(jì)，相同的保留時間所需要的甲醇比例大。相對水作為流動相，乙酸銨的加入提高了化合物的響應(yīng);加入0.1%甲酸有助于化合物的離子化，可獲得較優(yōu)色譜分離效果和質(zhì)譜信號響應(yīng)，得到的峰形對稱、尖銳，且基線平穩(wěn)。所以，采用甲醇-10 mmol/L 的乙酸銨(0.1%甲酸)溶液體系作為流動相。

5.2 色譜柱的選擇 筆者對Agilent SB-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)、Agilent Extend-C18(2.1 mm ×50 mm，1.8 μm)、Agilent ZORBAX Eclipse plus-C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)、Waters ACQUITY BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)、Hypersil GOLD C18(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)5 根色譜柱進(jìn)行考察，結(jié)果Agilent SB-C18色譜柱能使待測的3 種組分均有適宜的保留，且各組分的分離效果較佳。

5.3 檢測波長的確定 國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗補(bǔ)充檢驗方法和檢驗項目批準(zhǔn)件(批件號2009031)［14］中醋酸潑尼松和馬來酸氯苯那敏的檢測波長設(shè)定為225 nm，文獻(xiàn)報道土霉素的檢測波長為280 nm［12］。本實驗共設(shè)計了225、240、260、265、280 nm 5 個檢測波長，通過二極管陣列檢測器在190 ～400 nm 波長范圍內(nèi)掃描，在260 nm 處3 種成分有比較理想的色譜峰響應(yīng)值，因此選擇260 nm 作為三者的檢測波長。

5.4 3 種非法添加物的確認(rèn) “咳喘王膠囊”和“清肺膠囊中”中都以麝香、川貝、甘草、苦參、地龍等作為主要原料，有止咳平喘功效。按照國家食品藥品監(jiān)督管理局《藥品檢驗補(bǔ)充檢驗方法和檢驗項目批準(zhǔn)件》，對疑似出現(xiàn)不良反應(yīng)的止咳平喘類膠囊進(jìn)行檢驗，通過液質(zhì)聯(lián)用法檢出其非法添加醋酸潑尼松和馬來酸氯苯那敏。對準(zhǔn)分子離子m/z 461 未知物質(zhì)色譜峰，通過數(shù)據(jù)庫篩查發(fā)現(xiàn)土霉素的［M + H］+為461，且匹配值 (Score 98.89)很高，筆者懷疑其添加了土霉素。采用土霉素對照品與樣品進(jìn)行UPLC-DAD、MS、MS/MS分析，最終確證咳喘王膠囊、清肺膠囊中均非法添加土霉素。

醋酸潑尼松為糖皮質(zhì)激素類藥物，與大劑量抗菌素合用有良好的抗炎、抗毒及促進(jìn)癥狀緩解等作用;馬來酸氯苯那敏用于如過敏性鼻炎、哮喘、過敏性皮炎等各種過敏性疾病的抗組胺類藥;土霉素為廣譜抗生素，對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌都有抑制作用，對衣原體、支原體等也有一定的抑制作用。筆者認(rèn)為添加者想通過在咳喘王膠囊、清肺膠囊中添加土霉素、馬來酸氯苯那敏、醋酸潑尼松三種成分對患者達(dá)到“強(qiáng)效、速效”治療哮喘的效果。

6 結(jié)論

本實驗利用UPLC/Q-TOF/MS 技術(shù)將色譜的高分離性能和質(zhì)譜的高鑒別能力相結(jié)合檢測“咳喘王膠囊”和“清肺膠囊”，結(jié)合保留時間、DAD 紫外光譜圖、一級質(zhì)譜、二級質(zhì)譜碎片信息等4 方面信息以及數(shù)據(jù)庫，使得檢測結(jié)果得以確證，最終建立了同時檢測止咳平喘中藥制劑中非法添加土霉素、馬來酸氯苯那敏、醋酸潑尼松的分析方法。本方法還適用于篩查中藥制劑是否摻入其他8 種止咳平喘類化學(xué)藥(茶堿、磺胺甲噁唑、醋酸潑尼松、地西泮、馬來酸氯苯那敏、鹽酸苯海拉明、枸櫞酸噴托維林、磷酸苯丙哌林)，故此方法的建立能夠給科研工作者及檢測人員提供一定的參考價值，同時對打擊止咳平喘類中藥制劑非法添加西藥成分的制假行為，保證人民群眾用藥安全具有現(xiàn)實意義。

［1］ 劉起中，李慧義，杭太俊. 中藥制劑中非法摻入化學(xué)藥物成分的測定［J］. 中國藥師，2007，10(8):735-737.

［2］ 張純萍，劉艷華，門立強(qiáng)，等. 牛奶中四環(huán)素類藥物殘留的確證方法—液質(zhì)聯(lián)用法［J］. 中國獸醫(yī)學(xué)報，2005，25(6):649-654.

［3］ 張翠英，李振國，徐金鈴. UPLC-MS 法檢測止咳平喘制劑中非法添加茶堿、醋酸潑尼松、醋酸地塞米松［J］. 中成藥，2008，30(9):1326-1330.

［4］ 張西如，姜建國，張素萍. LC-MS 檢測復(fù)方川羚定喘膠囊中添加的醋酸潑尼松［J］. 中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2009，26(4):320-322.

［5］ 孔衛(wèi)東，周世玉. 高效液相色譜法檢測止咳平喘類中成藥中非法添加的醋酸潑尼松、茶堿［J］. 中國藥業(yè)，2013，22(14):55-56.

［6］ 張裕民. HPLC 法檢測止咳平喘類中成藥摻入化學(xué)藥品的方法［J］. 中國藥事，2010，24(12):1213-1215.

［7］ 吳小紅. 中成藥及保健品非法添加化學(xué)藥品的檢測方法學(xué)研究［D］. 長沙:中南大學(xué)，2009:58-64.

［8］ 董 宇，高廣慧，矯筱蔓，等. 液質(zhì)聯(lián)用法檢測中藥制劑中添加的腎上腺皮質(zhì)激素［J］. 中國藥事，2013，27(1):51-54.

［9］ 姚 羽，田頌九，張正行，等. 中成藥及中藥保健品中非法添加抗組胺藥物的檢測方法研究［J］. 中國藥物與臨床，2009，9(8):720-721.

［10］ 滕南雁，何頌華，施曉光. 舒眠膠囊中非法添加氯苯那敏的檢測方法研究［J］. 中國藥師，2011，14 (8):1147-1149.

［11］ 趙晶晶，王 瑋，宋 揚(yáng). 高效液相色譜法測定中藥散劑中添加的土霉素［J］. 中國獸藥雜志，2013，47(1):36-38.

［12］ 李樹綱，金錄勝，王登臨，等. HPLC 法測定中獸藥散劑中非法添加土霉素的方法研究［J］. 中國獸藥雜志，2011，45(11):19-22.

［13］ 張 宏，張景艷，李樹綱，等. 5 種中獸藥散劑中非法添加土霉素檢查方法的研究［C］ // 《中國中藥雜志》第十屆編委會暨中藥新產(chǎn)品創(chuàng)制與產(chǎn)業(yè)化發(fā)展戰(zhàn)略研討高端論壇論文集. 北京:中國中醫(yī)科學(xué)院，《中國中藥雜志》社，2011:191-193.

［14］ 2009031，國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗補(bǔ)充檢驗方法和檢驗項目批準(zhǔn)件［S］.