王春秋， 李雯霞

(河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院 河南省骨科醫(yī)院，河南 洛陽(yáng)471002)

金銀花又名忍冬，為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb 的干燥花蕾或初開(kāi)的花，其性寒，味甘，入肺、心、胃經(jīng)，具有清熱解毒、抗炎、補(bǔ)虛療風(fēng)等功效［1-3］?，F(xiàn)代藥理研究表明，金銀花有著抗炎、解熱、增強(qiáng)免疫、抗菌、興奮中樞、降血脂、抗內(nèi)毒素等作用［4-7］?！吨袊?guó)藥典》2010 版以綠原酸和木犀草苷為金銀花質(zhì)量控制的指標(biāo)，但此兩者均不能全面代表其質(zhì)量和功效。金銀花含有機(jī)酸、黃酮、皂苷及鞣質(zhì)等化學(xué)成分，目前的測(cè)定方法主要有HPLC 法、紫外分光光度法、近紅外光譜法、毛細(xì)管電泳法等［8-11］，但毛細(xì)管電泳法和近紅外光譜法所需儀器的價(jià)格較昂貴，紫外分光光度法測(cè)得結(jié)果的準(zhǔn)確度較差，而HPLC 法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確、效率較高、應(yīng)用較廣，可作為同時(shí)測(cè)定多種化學(xué)成分的方法，并能簡(jiǎn)化繁瑣的實(shí)驗(yàn)過(guò)程。但是，目前金銀花藥材中所測(cè)定的化學(xué)成分較為單一，尚無(wú)同時(shí)測(cè)得多種成分的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)同時(shí)測(cè)定該植物中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、槲皮素、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 的含有量，用來(lái)建立完善的金銀花質(zhì)量控制方法。

1 儀器、試藥和材料

Waters 2695 HPLC 色譜儀，包括2998 紫外檢測(cè)器、四元梯度泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器(美國(guó)Waters 公司);KQ-100 超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Sartorius BP211D 分析天平(德國(guó)賽多利斯集團(tuán))。綠原酸(批號(hào)110753-200413)、蘆丁 (批號(hào)100080-200707)、木犀草苷 (批號(hào)111720-201106)、槲皮素(批號(hào)100081-200907)、咖啡酸(批號(hào)110885-200102)對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所);新綠原酸 (批號(hào) MUST-10091501)、隱綠原酸(批號(hào)905997)、異綠原酸A (批號(hào)A0025)、異綠原酸B (批號(hào)071130)、異綠原酸C (批號(hào)MUST-09041001)對(duì)照品(成都曼思特生物科技有限公司)。甲醇、乙腈均為色譜純(迪馬科技有限公司);其他試劑均為分析純;水為超純水(自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗(yàn) Agilent C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈(A)-0.2% 磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0 ～15 min，10%～20% A;15 ～40 min，20%～30% A;40 ～60 min，30% ～55% A);柱溫30 ℃;體積流量1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm。理論塔板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算，不低于2 000，HPLC 結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品和供試品的HPLC 圖Fig.1 HPLC of hybrid reference substances and test samples

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、槲皮素、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 對(duì)照品適量，置于10 mL 量瓶中，加50% 甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，配制成相應(yīng)的貯備液。然后，精密吸取各貯備液適量，置于25 mL 量瓶中，加50%甲醇溶解，稀釋至刻度，即得混合對(duì)照品溶液(每1 mL 溶液中分別含有新綠原酸0.114 mg、綠原酸0.794 mg、隱綠原酸0.051 mg、咖啡酸0.013 mg、蘆丁0.015 mg、木犀草苷0.008 mg、槲皮素0.013 mg、異綠原酸B 0.023 mg、異綠原酸A 0.215 mg、異綠原酸C 0.351 mg)。

2.3 供試品溶液的制備 取金銀花粉末適量，過(guò)3 號(hào)篩，精密稱取0.2 g，加入50% 甲醇10 mL，超聲處理(250 W、50 kHz)20 min，放冷，50%甲醇補(bǔ)足減少質(zhì)量，搖勻，0.45 μm 濾膜過(guò)濾，即得。

2.4 線性關(guān)系試驗(yàn) 分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2、5、10、15、20 μL，注入色譜儀，以進(jìn)樣量(μg)為自變量(x)，色譜峰面積為因變量(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法在較大范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，見(jiàn)表1。

表1 金銀花中10 種成分的回歸分析結(jié)果Tab.1 Result of the regression analysis of 10 chemical constituents in Lonicera japonica Thunb

2.5 儀器精密度 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，計(jì)算峰面積RSD。結(jié)果，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、槲皮素、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 的RSD 分別為1.8%、0.6%、0.8%、2.0%、1.6%、2.2%、1.9%、2.6%、2.7%、2.8%，表明儀器精密度良好。

2.6 方法穩(wěn)定性 精密吸取“2.3”項(xiàng)下同一供試品溶液20 μL，分別于0、1、2、3、4、6、8、12，24 h進(jìn)樣，計(jì)算峰面積RSD。結(jié)果，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、槲皮素、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 的RSD 分別為1.4%、0.4%、1.0%、1.8%、1.8%、2.5%、2.1%、2.1%、2.9%、2.6%，表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.7 方法重復(fù)性 取同一批樣品，共6 份，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣體積20 μL，以峰面積外標(biāo)法計(jì)算其含有量。結(jié)果，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、槲皮素、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 的含有量分別為1.59、28.48、0.64、0.22、0.19、0.09、0.15、0.28、7.43、2.67 mg/g，RSD分別為 1.4%、1.3%、1.1%、1.3%、0.6%、1.7%、1.8%、2.3%、2.3%、2.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 方法回收率 精密稱取已測(cè)定含有量的樣品(產(chǎn)地江蘇南通)6 份，每份0.1 g，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并測(cè)定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、槲皮素、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 的含有量。然后，精密加入混合對(duì)照品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，各成分的回收率分別為 97.9%、100.2%、102.9%、99.7%、103.1%、100.7%、101.1%、99.5%、100.8%、102.2%，見(jiàn)表2，表明該方法回收率良好。

表2 金銀花中10 種成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Result of recovery tests of 10 chemical constituents in Lonicera japonica Thunb

續(xù)表2

2.9 樣品測(cè)定 取10 個(gè)不同產(chǎn)地的金銀花藥材適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，然后以外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算各成分的含有量，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用RP-HPLC 法，同時(shí)對(duì)金銀花中的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、槲皮素、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 進(jìn)行含有量測(cè)定和相應(yīng)的方法學(xué)考察。例如，金銀花中這些化學(xué)成分的最大吸收波長(zhǎng)均在350 nm 左右，因此本實(shí)驗(yàn)選擇350 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。同時(shí)，還研究了不同系統(tǒng)的流動(dòng)相，包括乙腈-水和甲醇-水溶液，發(fā)現(xiàn)當(dāng)以乙腈-水溶液為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰的峰型和分離度均良好，而且保留時(shí)間理想，故選擇其作為流動(dòng)相。另外，本實(shí)驗(yàn)所采用梯度洗脫的比例變化和步驟較小，克服了傳統(tǒng)洗脫因其復(fù)雜性所導(dǎo)致的重復(fù)性較低和基線不穩(wěn)等問(wèn)題，但隨后注意到，在該流動(dòng)相系統(tǒng)中，各峰形情況不佳，對(duì)稱因子未全部達(dá)到要求，故又考察了流動(dòng)相pH 對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。結(jié)果顯示，隨著磷酸濃度的加大(0.1%、0.2%、0.3%)，峰形越來(lái)越理想，其中在0.2%磷酸水溶液條件下的分離效果最好，而且各峰的對(duì)稱因子均在0.95 ～1.05 之間，因此確定乙腈-0.2%磷酸水溶液系統(tǒng)為流動(dòng)相。

研究表明［12-14］，不同產(chǎn)地金銀花中各化學(xué)成分的差異較大，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，并發(fā)現(xiàn)新綠原酸的含有量差異最大。郝江波等［15］報(bào)道，加工和貯藏過(guò)程對(duì)金銀花的化學(xué)成分具有較大影響，表現(xiàn)在成分的種類和含有量上，而本實(shí)驗(yàn)10 個(gè)不同來(lái)源金銀花藥材中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、槲皮素、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 的含有量差異均較大，可能與其產(chǎn)地、加工、貯藏等因素有關(guān)。由此表明，在對(duì)金銀花質(zhì)量進(jìn)行控制時(shí)，不應(yīng)僅把其中的單一成分作為控制指標(biāo)，并且需注意加工和貯藏條件。本實(shí)驗(yàn)對(duì)金銀花中的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、槲皮素、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 這10 個(gè)化學(xué)成分進(jìn)行檢測(cè)，可為其質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

表3 不同產(chǎn)地金銀花中10 種成分的分析結(jié)果(n=3，mg/g)Tab.3 Analysis result of 10 chemical constituents in Lonicera japonica Thunb from different growing areas (n=3，mg/g)

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