劉 宇， 張明明， 劉墨祥

(揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院 天然藥物研究室，江蘇 揚(yáng)州225000)

速效止瀉膠囊是依據(jù)《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第13 冊(cè)制訂的處方和制法而生產(chǎn)的中成藥，該制劑由鹽酸小檗堿和拳參組成，其主要功能為清熱利濕，收斂止瀉，用于赤痢、熱瀉、腸炎等［1］。拳參具有清熱解毒、消腫、止血之功效，主治赤痢熱瀉、肺熱咳嗽、癰腫瘰疬、口舌生瘡、血熱吐衄、痔瘡出血、蛇蟲咬傷［2］?，F(xiàn)代抗菌實(shí)驗(yàn)表明拳參對(duì)金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、枯草桿菌、大腸桿菌等均有抗菌作用［3-4］，其有效成分主要為沒食子酸和綠原酸。有文獻(xiàn)報(bào)道了測定速效止瀉膠囊中鹽酸小檗堿［5-7］和沒食子酸及綠原酸的含有量［8-10］，但拳參原藥材對(duì)膠囊質(zhì)量的檢測影響均沒有提及。鑒于速效止瀉膠囊中鹽酸小檗堿［11-12］是以化合物定量加入質(zhì)量可控，而其中的沒食子酸、綠原酸、兒茶酚及可水解生成沒食子酸的鞣質(zhì)等有效成分的含有量則隨拳參原料藥材的質(zhì)量而異，需有效技術(shù)監(jiān)控。所以，本研究擬針對(duì)速效止瀉膠囊中拳參的主要有效成分沒食子酸和綠原酸兩個(gè)指標(biāo)建立簡便、靈敏、準(zhǔn)確的RP-HPLC 定量檢測方法與技術(shù)，并針對(duì)速效止瀉膠囊中拳參所共有的多個(gè)指標(biāo)成分建立專屬性強(qiáng)、方法簡便的高效液相色譜指紋圖譜定性鑒別方法與技術(shù);同時(shí)對(duì)野生拳參特征峰進(jìn)行識(shí)別。

1 儀器與試藥

Waters 高效液相色譜儀，包括Waters 1525 Binary HPLC Pump 色譜泵，Waters 2487 雙通道紫外檢測器，色譜柱恒溫箱;Waters SymmetrySheildTMRP18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，包括Empower 色譜工作站;Sartorius CAP225 電子天平(德國賽多利斯公司)。沒食子酸對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，純度為0.899，批號(hào)110831-201204);綠原酸對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，純度為0.966，批號(hào)110753-201314)。速效止瀉膠囊 (甘肅岷海制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)130701)。野生拳參飲片(蘇北人民醫(yī)院)，經(jīng)揚(yáng)州大學(xué)劉墨祥教授鑒定。乙腈和甲醇為色譜純;甲酸為分析純;水為超純水。

2 溶液制備

2.1 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱定適量沒食子酸和綠原酸對(duì)照品，加50%甲醇制成對(duì)照品混合溶液，其中沒食子酸質(zhì)量濃度為183.39 μg/mL，綠原酸質(zhì)量濃度為208.65 μg/mL。

2.2 供試品溶液制備 從同一批次膠囊中取出10粒，將膠囊粉末混合并研細(xì)，取0.1 g，精密稱定后，置于10 mL 具塞試管中，精密加入6 mL 50%甲醇，密封并稱定質(zhì)量，浸泡2 h，30 ℃下超聲20 min，冷卻至室溫后再稱定質(zhì)量，加50%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，過0.45 μm 濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 陰性樣品溶液制備 按處方制備不含拳參的陰性樣品，取適量，按“2.2”項(xiàng)方法制成陰性樣品溶液。

3 色譜條件

采用Waters SymmetrySheildTMRP18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mmm);流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液(A)-乙腈 (B)，梯度洗脫 (0 ～10 min，92.5%A;10 ～11 min，92.5% ～90% A;11 ～40 min，90%A);體積流量0.8 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長290 nm;通過20 μL 定量環(huán)保持進(jìn)樣量恒定。

4 方法與結(jié)果

4.1 專屬性試驗(yàn) 分別吸取供試品溶液、對(duì)照品混合溶液和陰性樣品溶液注入液相色譜儀，按照上述色譜條件測定，進(jìn)樣量均為20 μL，記錄色譜圖。沒食子酸和綠原酸的保留時(shí)間分別為8.824 min 及34.573 min，待測組分峰形良好且與相鄰組分達(dá)到基線分離，不受其他組分干擾，分離度均大于2，理論塔板數(shù)以沒食子酸和綠原酸計(jì)算均大于8 000 (見圖1)。

4.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品混合溶液2 mL，精密吸取1 mL 置于指形管中作為待測樣品1，剩余的1 mL 對(duì)照品混合溶液中精密加入50%甲醇1 mL，得到2 mL 稀釋了1 倍的對(duì)照品混合溶液。按上述方法重復(fù)操作4 遍，得到倍比稀釋的6 個(gè)質(zhì)量濃度樣品溶液，在上述色譜條件下，分別注入液相色譜儀，進(jìn)樣量均為20 μL。以對(duì)照品質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(C)，測定的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得沒食子酸和綠原酸線性回歸方程為Y=5.618 7 ×104C-0.164 53 × 104(r = 1);Y = 5.577 9 × 104C -12.202 8 ×104(r =0.999 9)。結(jié)果表明沒食子酸在5.73 ～183.39 μg/mL、綠原酸在6.52 ～208.65 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 混合對(duì)照品、樣品和陰性樣品色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances，samples and negative sample

4.3 精密度試驗(yàn) 吸取對(duì)照品混合溶液，按照上述色譜條件測定，進(jìn)樣量為20 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積。結(jié)果沒食子酸峰面積的RSD 為1.4%，綠原酸峰面積的RSD 為0.6%，表明所用儀器的精密度良好。

4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批(批號(hào)130701)膠囊粉末5 份，每份0.1 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，依法測定。沒食子酸平均含有量為1.45 mg/g (RSD =1.2%)，綠原酸平均含有量為5.34 mg/g (RSD =1.1%)，表明方法重復(fù)性良好。

4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 吸取同一供試品溶液(批號(hào)130701)，按上述色譜條件間隔不同時(shí)間測定5 次，沒食子酸和綠原酸RSD 分別為1.1%和0.7%，表明供試品溶液在室溫條件下放置12 h 后沒食子酸和綠原酸的質(zhì)量濃度無明顯改變，方法穩(wěn)定可行。

4.6 加樣回收試驗(yàn) 參照“4.4”項(xiàng)下所測樣品中沒食子酸和綠原酸的含有量，精密稱取沒食子酸和綠原酸對(duì)照品適量，分別加入50%甲醇制得供加樣回收用對(duì)照品溶液，其中沒食子酸和綠原酸質(zhì)量濃度分別為141.07 μg/mL 和521.64 μg/mL。稱取“2.2”項(xiàng)下研細(xì)的膠囊粉末樣品 (批號(hào)130701)約0.1 g，共5 份，精密稱定，在樣品中分別精密加入上述對(duì)照品溶液沒食子酸1 mL、綠原酸1 mL、50%甲醇4 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算回收率(見表1)。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=5)Tab.1 Result of recovery tests (n=5)

5 樣品測定

按上述色譜條件，對(duì)不同批次的速效止瀉膠囊樣品進(jìn)行測定，記錄峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算沒食子酸和綠原酸量(見表2)。

表2 樣品測定結(jié)果(n=5)Tab.2 Result of determination of samples (n=5)

6 討論

6.1 沒食子酸峰和綠原酸峰的確認(rèn) 文獻(xiàn)［13-14］報(bào)道拳參中含有沒食子酸和綠原酸，而在本實(shí)驗(yàn)色譜條件下，速效止瀉膠囊提取樣品的兩個(gè)色譜峰與沒食子酸和綠原酸對(duì)照品的色譜峰保留時(shí)間一致，且紫外光譜圖吻合，于是將樣品進(jìn)行HPLCMS 鑒定，在正負(fù)離子檢測條件下，8.5 min 時(shí)分別出現(xiàn)m/z 171、169 分子離子峰，34.5 min 時(shí)分別出現(xiàn)m/z 355、353 (見圖2)分子離子峰，本實(shí)驗(yàn)對(duì)速效止瀉膠囊提取樣品中保留時(shí)間為8.5 min和34.5 min 的色譜峰從保留時(shí)間、紫外光譜圖、相對(duì)分子質(zhì)量三方面驗(yàn)證其分別為沒食子酸和綠原酸。

圖2 沒食子酸與綠原酸質(zhì)譜圖Fig.2 Spectra of gallic acid and chlorogenic acid

6.2 提取方法、溶劑、時(shí)間的考察 樣品中沒食子酸和綠原酸來自拳參粉末，參考文獻(xiàn)［13-14］，提取方法和時(shí)間考察了冷浸法，分別考察了冷浸2 h后30 ℃超聲20、40 min 及冷浸放置過夜后30 ℃超聲20、40 min。結(jié)果表明冷浸2 h 后超聲提取待測組分沒食子酸和綠原酸提取效果比較好，而且節(jié)省時(shí)間，所以提取方法確定為冷浸2 h 后30 ℃超聲20 min。所測組分為酚酸類，易溶于水和強(qiáng)極性溶劑中，考察了水、20% 乙醇、50% 乙醇、30%甲醇、50%甲醇的提取情況。結(jié)果顯示50%甲醇提取效果比較好，確定提取溶劑為50%甲醇。

6.3 流動(dòng)相的選擇 對(duì)甲醇-超純水(25 ∶75)、甲醇-0.4%冰醋酸(25 ∶75)、甲醇-0.1 磷酸(10∶90)、乙腈-0.4%冰醋酸(10 ∶90)、乙腈-0.1%磷酸(10 ∶90)、乙腈-0.1%甲酸(梯度)不同流動(dòng)相進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)乙腈作為有機(jī)相時(shí)系統(tǒng)柱壓比較小，流動(dòng)相中加入一定量甲酸和磷酸均可改善峰形和分離度，為了增加色譜柱的穩(wěn)定性和使用壽命，以及后期液質(zhì)聯(lián)機(jī)對(duì)指紋峰識(shí)別時(shí)不適合用磷酸，所以選用乙腈-0.1 甲酸(梯度)。

6.5 檢測波長的選擇 沒食子酸在220 nm 及270 nm 處有最大吸收，綠原酸在218 nm 及327 nm 處有最大吸收，為使二者均有較好且相當(dāng)?shù)撵`敏度，選擇290 nm 為檢測波長［15］。

［1］ 《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第13 冊(cè):速效止瀉膠囊［S］.

［2］ 國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典:2010 年版二部［S］. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:271.

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