張?zhí)熘?楊世海， 代文意， 吳國(guó)梁

(1. 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春130117;2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春130117)

急性肺損傷(ALI)是以肺血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞廣泛損傷為病理特征的一種失控的炎癥反應(yīng)［1］。近年來，ALI/急性呼吸窘迫綜合征 (ARDS)越來越受到重視［2］。國(guó)內(nèi)發(fā)病率和病死率達(dá)20% ～40%，尤其ICU 病房中達(dá)到50%左右，目前沒有效治療手段［3］。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，有40%的膿毒癥患者伴發(fā)ALI/ARDS［4］;革蘭氏陰性細(xì)菌是膿毒癥的重要致病因子，其細(xì)胞壁的脂多糖(LPS)可通過多種途徑導(dǎo)致ALI［5-6］。ALI/ARDS 是膿毒癥患者死亡的主要原因。對(duì)ALI /ARDS 發(fā)病機(jī)制的大量研究表明炎癥反應(yīng)在其發(fā)病過程中起重要作用［7-9］。因此，尋找有效藥物治療LPS 誘導(dǎo)ALI 對(duì)膿毒癥的治療具有重要臨床意義。

人參皂苷Rg1(ginsenoside Rg1)是人參、三七等藥材主要有效成分之一，如促進(jìn)血管生成與組織再生，治療老年癡呆，對(duì)抗缺血再灌注損傷及神經(jīng)保護(hù)作用等［10-11］。及抗腫瘤抗衰老雌激素樣作用免疫調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)糖代謝等［12-15］。目前對(duì)人參皂苷Rg1抗炎和鎮(zhèn)痛作用研究較少，尤其對(duì)于急性肺損傷作用報(bào)道鮮見，本研究重點(diǎn)探討人參皂苷Rg1對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷的保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)BABL/C 小鼠，雄性，6 ～8 周齡，體質(zhì)量21 ～23 g，小鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食，中國(guó)藥科大學(xué)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物批準(zhǔn)文號(hào)SCXK (蘇)20070001。

1.2 藥品與試劑 人參皂苷Rg1(批號(hào)110703-201326)購自中國(guó)食品藥品檢定研究院;LPS (L2880，大腸桿菌055 類型B5)購自Sigma 公司;IL-6 (批號(hào)20130527)、IL-1 β (批號(hào)20131112)、TNF-α (批號(hào)20130401)購自南京建成生物有限公司;NF-кBp65 (4764s)、COX-2 (4842s)抗體購自CST 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及模型建立 將雄性BALB/c 小鼠50 只隨機(jī)分為5 組，每組10 只，即對(duì)照組(control)、LPS 組、地塞米松組 (Dex，2 mg/kg)、人參皂苷Rg1(10 mg/kg)組、人參皂苷Rg1(20 mg/kg)組。分別以雙蒸水(0.1 mL/10 g)、雙蒸水(0.1 mL/10 g)、地塞米松(2 mg/kg)、Rg1(10 mg/kg，0.1 mL/10 g)、Rg1(20 mg/kg，0.1 mL/10 g)灌胃，每日1 次，連續(xù)3 d 給藥。第3 天灌胃后1 h，腹腔注射生理鹽水(0.1 mL/10 g)或LPS (10 mg/kg，0.1 mL/10 g)，6 h 后處死，取血清凍存，肺組織置4%甲醛溶液中，用于HE 染色，其余肺組織-80 ℃凍存，以便用于Westen blot 檢測(cè)。

1.4 病理學(xué)檢查 腹腔注射生理鹽水或LPS 后6 h 處死小鼠，切取左肺，以4%的甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片及常規(guī)HE 染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。

1.5 肺泡灌洗液炎癥因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)檢測(cè)取已處死動(dòng)物，打開胸腔，結(jié)扎左支氣管肺門部;分離氣管，于氣管環(huán)狀軟骨下方剪一V 型切口，插入前端磨平的2.5 mL 注射器針頭，結(jié)扎固定，以1.5 mL 生理鹽水分3次灌洗，每次0.5 mL。取一滴灌洗液至血細(xì)胞計(jì)數(shù)池中，靜置后顯微鏡下讀白細(xì)胞總數(shù)。1 000 r/min 室溫下離心10 min，吸出上清液，按照IL-6、IL-1β、TNF-α 試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 Western blot 檢測(cè) 將肝組織置于冰冷的裂解液收集裂解物總蛋白，組織蛋白行SDS-PAGE 并轉(zhuǎn)印至PVDF 膜;室溫封閉2 h，分別與NF-кBp65 和COX-2 一抗孵育，膜經(jīng)漂洗后再與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗反應(yīng)，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光試劑顯影，灰度成像軟件(UVP，UK)測(cè)定主帶的光密度值以計(jì)算NF-кB p65 和COX-2 蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg1對(duì)急性肺損傷小鼠血液SOD、MDA 的影響 與空白組相比，急性肺損傷模型組的血清的SOD 水平顯著降低、MDA 水平顯著增加，給予人參皂苷Rg1治療后血清SOD 顯著升高，MDA 顯著降低(圖1)。

圖1 人參皂苷Rg1 對(duì)急性肺損傷小鼠血液SOD、MDA 的影響

2.2 人參皂苷Rg1對(duì)急性肺損傷小鼠肺泡灌洗液炎癥因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)的影響 與空白組相比，急性肺損傷模型組的肺泡灌洗液炎癥因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)水平顯著增加，給予人參皂苷Rg1治療后肺泡灌洗液炎癥因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)顯著降低(圖2)。

圖2 人參皂苷Rg1 對(duì)急性肺損傷小鼠肺泡灌洗液炎癥因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)的影響

2.3 氣道病理學(xué)檢測(cè) 空白組肺部被覆上皮完整，未見明顯壞死、脫落，固有層及黏膜下層中未見充血、水腫及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，外膜可見完好的透明軟骨支架。模型組可見肺部中度炎細(xì)胞浸潤(rùn)，主要包括中性細(xì)胞，淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及少量漿細(xì)胞。較之模型組，各給藥組病變都有減輕趨勢(shì)，見圖3。

圖3 人參皂苷Rg1 顯著改善LPS 誘導(dǎo)的肺損傷小鼠的肺部病理學(xué)變化(×200)

2.4 人參皂苷Rg1對(duì)急性肺損傷小鼠肺NF-кBp65 和COX-2 的影響 與空白組相比，急性肺損傷模型組的NF-кBp65和COX-2 顯著增加，給予Rg1治療后肺NF-кBp65 和COX-2顯著降低(圖4)。

圖4 人參皂苷Rg1 對(duì)急性肺損傷小鼠肺NF-кBp65 和COX-2 的影響

3 討論

ALI 是以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的炎癥反應(yīng)微血管和肺泡上皮彌漫性損傷肺水腫及肺間質(zhì)纖維化等為病理特征的一種臨床綜合征，嚴(yán)重者即為ARDS，可由創(chuàng)傷肺炎和膿毒癥等引起。本實(shí)驗(yàn)利用脂多糖建立急性肺損傷模型來評(píng)價(jià)Rg1抗肺損傷藥理機(jī)制，發(fā)現(xiàn)Rg1能顯著降低肺損傷小鼠肺泡灌洗液中的炎癥因子，能顯著降低血清中MDA 水平，提高SOD 水平，并能抑制肺部NF-кBp65 和COX-2 蛋白表達(dá)，提示Rg1可能通過調(diào)節(jié)NF-кBp65 和COX-2 蛋白表達(dá)來保護(hù)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷。

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