井發(fā)紅，慕玉東，辛 娜，李敬梅，康 煒(西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科，西安 70077;陜西省腫瘤醫(yī)院檢驗科;通訊作者，E-mail:kttw008@6．com)

成人和兒童菌血癥都是高發(fā)病率和高死亡率的疾病，每年世界范圍內(nèi)菌血癥患者有2 000萬例［1］。因病原菌不能鑒定而應(yīng)用廣譜抗生素或不適當(dāng)抗生素治療所導(dǎo)致的死亡率非常高，美國血流感染的總體病死率可高達14%-63%，但在明確病原菌后采用針對性治療，其死亡率可降至5%-17%［2-4］，因此及時快速診斷病原菌對合理用藥、縮短療程等具有重要意義。迄今為止，血培養(yǎng)仍然是診斷血流感染的金標(biāo)準(zhǔn)［5］，它不僅可以檢測血液中有無病原菌，還可對分離出的病原菌進行藥敏試驗，因此血培養(yǎng)對血流感染的診治具有重要意義。然而，血培養(yǎng)一般至少需要3-5 d的時間，且易受標(biāo)本質(zhì)量、標(biāo)本中病原體數(shù)量、培養(yǎng)條件以及抗生素治療等多種因素的影響，陽性率較低;同時，有些病原體雖能被培養(yǎng)出，但應(yīng)用傳統(tǒng)的方法很難對其進行鑒定，這些遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床對血流感染快速診斷和治療的需要［6］。近年來，分子生物學(xué)和基因診斷技術(shù)的不斷發(fā)展為血流感染的檢測提供了新的思路。病原菌的基因組較生化指標(biāo)穩(wěn)定，通過基因擴增及其后續(xù)技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確地檢測病原菌。本研究主要構(gòu)建熔解曲線分析法，并進行特異性驗證。檢測不同拷貝濃度稀釋液進行敏感性分析。利用絕對定量法測定血液及穿刺引流液中鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌和表皮葡萄球菌的含量。

1 材料與方法

1．1 檢測菌種與PCR擴增靶基因的確定

本研究選擇的標(biāo)準(zhǔn)菌株鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii A601)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae ATCC700603)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis ATCC 8558)由衛(wèi)生部臨床檢驗中心提供。針對鮑曼不動桿菌的ITS、肺炎克雷伯菌的phoE和表皮葡萄球菌的gseA基因作為PCR擴增的靶基因。

1．2 引物設(shè)計

分別對靶基因序列使用Primer Primer5．0軟件設(shè)計引物，經(jīng)BLAST比對選擇特異性較高引物，引物均由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。實驗中PCR擴增所用靶基因、引物序列、產(chǎn)物大小和退火溫度(見表1)。

表1 實驗中PCR擴增所用引物Table 1 Primers for PCR amplification

1．3 主要試劑與儀器

PCR反應(yīng)試劑(包括Taq酶及緩沖液，MgCl2、dNTP)以及DL1000 DNA Marker和pMD?18-T載體均為大連TaKaRa產(chǎn)品，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒(離心柱型)和感受態(tài)DH5a均為北京天根產(chǎn)品，SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒為上海生工產(chǎn)品。SYBR Green Realtime PCR Master Mix是日本TOYOBO產(chǎn)品。CFX96 TM realtime定量PCR系統(tǒng):美國Bio-rad產(chǎn)品;PCR擴增儀(GeneAmp PCR System 2720)為美國ABI產(chǎn)品;電泳儀(DYY6C)為北京六一產(chǎn)品;紫外凝膠成像系統(tǒng)(Ingenius LHR SYSTEM，200V)為英國 Syngene產(chǎn)品;NanoPhotometerTM為德國IMPLEN產(chǎn)品。

1．4 細(xì)菌基因組DNA的提取與擴增產(chǎn)物純化

細(xì)菌基因組DNA的提取:應(yīng)用“天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒”提取經(jīng)純培養(yǎng)后的標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA，用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA大小。

擴增產(chǎn)物純化:用上海生工“SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒”對擴增產(chǎn)物進行純化，具體步驟按試劑盒說明書進行。

質(zhì)粒的提取:將DNA片段與pMD18-T載體的連接，然后將連接體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)菌DH5a上，進行藍(lán)白斑篩選挑取培養(yǎng)板上白色單菌落過夜培養(yǎng)待培養(yǎng)液明顯渾濁后準(zhǔn)備提取質(zhì)粒，應(yīng)用天根“TIAN-prep Mini Plasmid Kit”進行質(zhì)粒提取，具體步驟按試劑盒說明書進行。取增菌后的菌液1 ml，由上海生工生物工程有限公司進行測序鑒定。

1．5 引物的特異性驗證

對上述引物用標(biāo)準(zhǔn)菌株進行常規(guī)PCR擴增，同時設(shè)置陽性對照與陰性對照。常規(guī)PCR反應(yīng)的總體積為 50 μl，其中 10 × Buffer 5 μl，25 mol/L 的MgCl24 μl，2．5 mol/L 的 dNTP 4 μl，5 U/μl Taq 酶0．2 μl，上、下游引物各 1 μl，模板 DNA 4 μl，滅菌超純水30．8 ml。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s;56℃退火30 s;72℃延伸30 s，30個循環(huán);最后72℃延伸7 min。PCR擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳的電壓為6 V/cm，采用溴化乙錠(EB)染色20 min，拍照保存。

1．6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

用NanoPhotometerTM微量核酸/蛋白檢測儀測定所提重組質(zhì)粒濃度(ng/μl)，利用 Avogadro’s常數(shù)(1 mol溶液大約有6．022 141 5×1023拷貝數(shù))計算出溶液中質(zhì)粒拷貝數(shù)，為制作標(biāo)準(zhǔn)品原液。將原液進行倍比稀釋，對倍比稀釋液進行熔解曲線分析法實驗。

1．7 實時熒光定量PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

用鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌和表皮葡萄球菌這三種特異性引物分別進行熔解曲線分析法實驗。20 μl反應(yīng)體系包括SYBR Green Realtime PCR Mix 10 μl，10 μmol/L 的上、下游引物各 0．8 μl，DNA 模板 2 μl，滅菌超純水 6．4 μl。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性10 s;60℃退火15 s;72℃延伸45 s，40個循環(huán);于60℃15 s后采集熒光信號，熔解曲線分析條件為65℃ 10 s，0．5℃/s升溫至95℃并收集熒光信號。通過軟件得到絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(standard curve)、熔解曲線(melt curve)的Ct值、對數(shù)濃度值等數(shù)據(jù)。

1．8 實時熒光定量PCR對臨床標(biāo)本的檢測

用構(gòu)建好的熔解曲線法檢測血液及穿刺引流液中鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌的含量。

2 結(jié)果

2．1 引物特異性的驗證

菌種特異性引物擴增標(biāo)準(zhǔn)菌株，可見其PCR擴增產(chǎn)物與預(yù)期DNA片段大小吻合(見圖1):鮑曼不動桿菌208 bp，肺炎克雷伯菌142 bp，表皮葡萄球菌194 bp，且擴增條帶亮度較高，反映引物特異性較好，陰性對照無污染。

圖1 特異性引物擴增結(jié)果Figure 1 PCR results of specific primers

2．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果

以肺炎克雷伯菌為例，將標(biāo)準(zhǔn)品原液按10倍倍比稀釋后做定量 PCR，得到5．80×108-5．80×103個拷貝的模板循環(huán)數(shù)與熒光強度的擴增曲線，從圖2中可以看到擴增曲線間距基本對等，與倍比稀釋的模板吻合。以各倍比稀釋拷貝數(shù)的對數(shù)為橫軸，反應(yīng)過程中達到熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)(Ct)為縱軸，得到檢測該菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)，該曲線是檢測樣本的參照標(biāo)準(zhǔn)，參數(shù)為:E=88．7%，R=0．986，Slope=-3．625，熔解曲線分析為單峰，說明擴增產(chǎn)物單一，無非特異性擴增，排除反應(yīng)過程中假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，熔解溫度為88．5℃(見圖4，5)。

2．3 實時熒光定量PCR結(jié)果

定量分析血液標(biāo)本和穿刺引流液標(biāo)本中結(jié)果表明:三種菌在臨床血液標(biāo)本中的含量在103-107copy/ml之間，在穿刺引流液標(biāo)本中含量為104-108copy/ml(見表2)。

3 討論

實時熒光定量PCR正在快速地替代傳統(tǒng)的微生物檢測方法。該技術(shù)在封閉的反應(yīng)管中將PCR反應(yīng)與產(chǎn)物分析過程一次完成，并能自動進行實時動態(tài)監(jiān)測和數(shù)據(jù)分析，大大減少了交叉污染的幾率，操作簡單、檢測速度快、定量精確、敏感度高且重復(fù)性好。

圖2 肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)品擴增曲線Figure 2 Standard amplification curve of Klebsiella pneumoniae

圖3 肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 3 Standard curve of Klebsiella pneumoniae

圖4 肺炎克雷伯菌熔解曲線Figure 4 Melting curve of Klebsiella pneumoniae

圖5 肺炎克雷伯菌熔解峰圖Figure 5 Peak melting curve of Klebsiella pneumoniae

表2 標(biāo)本中表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌定量結(jié)果 (copy/ml)Table 2 The quantitative RT-PCR results of Staphylococcus epidermidis，Klebsiella pneumoniae Acinetobacter baumannii(copy/ml)

目前，應(yīng)用于血流感染的分子定量測定方法較少，而培養(yǎng)方法計算的CFU只能代表在平板接種過程中存活下來的活的微生物而不能計數(shù)死細(xì)胞、不能形成菌落的細(xì)胞以及從破碎細(xì)胞中釋放出來的游離微生物DNA。因此，人們對血流感染病人血中病原菌DNA的真正含量知之甚少。

許多敗血癥病人被收治到ICU中進行靶抗生素治療可以極大地減少死亡率。一份來自美國和加拿大15個ICU的2 600多病例的研究表明，從敗血癥休克開始到有效地抗生素應(yīng)用前，敗血癥的死亡危險率每小時增加6%-10%［7］。不幸的是，目前實驗室鑒定和分型血流感染病原菌的方法太慢，得到培養(yǎng)及藥敏結(jié)果所需時間長，不能為臨床提供及時的參考;而且，由于前期經(jīng)驗性廣譜抗生素大量應(yīng)用、血中微生物含量低等原因，使得敗血癥病人的血培養(yǎng)往往呈現(xiàn)假陰性。據(jù)報道，腦膜炎球菌在未經(jīng)抗生素治療前，從血培養(yǎng)檢出率可達50%，而在經(jīng)過抗生素治療后的患者檢出率不足5%［8］?？股氐拇罅繎?yīng)用不僅導(dǎo)致培養(yǎng)陽性率低，而且增加花費，還可能導(dǎo)致病人抗生素中毒，并可能促進微生物耐藥性的發(fā)生。

本實驗應(yīng)用實時熒光定量PCR方法對血流及穿刺引流液中的鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌進行定量分析，結(jié)果顯示qRT-PCR方法可準(zhǔn)確、敏感地檢測臨床標(biāo)本中的細(xì)菌含量。實驗中采用SYBR Green熒光染料的方法，該染料可以與DNA非特異性結(jié)合，為排除PCR反應(yīng)過程中可能形成的非特異性擴增和引物二聚體等對實驗結(jié)果的影響，我們不斷優(yōu)化反應(yīng)體系和程序，并設(shè)定熔解曲線，提高實驗結(jié)果的可靠性。同時，為了準(zhǔn)確定量，我們選擇了絕對定量的實驗方案，目的是得到臨床標(biāo)本中細(xì)菌的絕對拷貝數(shù)。首先分別從標(biāo)本中和標(biāo)準(zhǔn)菌株中擴增目的基因來制作定量標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)直接從標(biāo)本中擴增目的基因來制作標(biāo)準(zhǔn)品的方法符合定量PCR實驗的要求，特異性高、濃度穩(wěn)定、無非特異性片段等，因而可以作為實驗的標(biāo)準(zhǔn)品。完成三種細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作后，分別檢測了各菌在臨床標(biāo)本中的含量。本實驗結(jié)果表明血流細(xì)菌含量在103-107copy/ml之間，穿刺引流液中細(xì)菌含量在104-108copy/ml之間;引流液中的細(xì)菌含量比血液中要高。本部分實驗為闡明菌量與感染的關(guān)系以及抗生素的應(yīng)用對血流中細(xì)菌量的影響奠定了基礎(chǔ)。

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