羅 麗， 江 濤， 陳 聶

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶400016）

[藥理]

牡荊素對急性肺損傷小鼠的保護(hù)作用

羅 麗， 江 濤*， 陳 聶

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶400016）

目的研究牡荊素對C57BL/6雄性小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用。方法采用脂多糖（LPS）7mg/kg腹腔注射建立急性肺損傷小鼠模型。72只模型小鼠隨機(jī)分為正常組、牡荊素對照組、模型組、牡荊素治療低、中、高劑量組。觀察小鼠一般情況，檢測6 h后肺濕/干質(zhì)量比 （W/D），肺組織勻漿中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛 （MDA）水平，肺泡灌洗液中總蛋白水平，光鏡下觀察肺組織病理變化，檢測肺組織中NF-κBp65 mRNA的表達(dá)。結(jié)果與模型組相比，牡荊素低、中、高劑量組劑量依賴性地降低肺組織中TNF-α、MDA水平和肺泡灌洗液中總蛋白水平，升高SOD水平，降低肺濕質(zhì)量/干質(zhì)量比值，減輕病理損傷程度，抑制NF-κBp65 mRNA的表達(dá) （P＜0.05）。結(jié)論牡荊素能通過抗炎、抗氧化作用對急性肺損傷小鼠產(chǎn)生保護(hù)作用。

牡荊素；急性肺損傷；脂多糖

急性肺損傷屬于臨床急危重癥，以急性低氧性呼吸功能不全為主要臨床特征，以肺內(nèi)過度、失控的炎性反應(yīng)為發(fā)病本質(zhì)，感染是導(dǎo)致發(fā)病的常見原因［1］。急性肺損傷病死率高，病情進(jìn)展快，后期治療效果差，臨床用藥選擇較少。牡荊素取材廣泛，國內(nèi)多從薔薇科植物山楂成熟果實中提取，屬于黃酮類化合物［2］，具有明確的抗炎、抗氧化、抗腫瘤作用［3-5］，既往多用于治療心血管疾病。近年來研究表明，在小鼠肺炎癥模型中，牡荊素能抑制80%的中性粒細(xì)胞聚集［6］，但牡荊素用于急性肺損傷的研究卻少見報道。因此本實驗以脂多糖（LPS）作為致傷劑，復(fù)制急性肺損傷模型，使用低、中、高3種劑量牡荊素早期干預(yù)小鼠，測定肺組織中多種炎癥介質(zhì)和氧化指標(biāo)，檢測肺組織中NF-κBp65 mRNA的表達(dá)，了解牡荊素對急性肺損傷小鼠是否具有保護(hù)作用，為臨床用藥提供更進(jìn)一步選擇。

1 材料和方法

1.1 材料 牡荊素（≥95%）購于Sigma公司，臨用前將其溶于DMSO中。脂多糖 （LPS）（O55：B5）購于 Sigma公司。小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α，批號M130916-12a）的ELISA試劑盒購于欣博盛生物科技有限公司。小鼠超氧化物歧化酶（SOD，批號 20130828）、丙二醛 （MDA，批號20130831）試劑盒購于南京建成生物工程研究所。BCA蛋白測定試劑盒（NO.23225）購于Thermo公司。Trizol總RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒由thermo Fermentas公司提供。

1.2 實驗分組及模型建立 SPF級雄性C57BL/6小鼠72只，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供。普通飼養(yǎng)，觀察一周無異常后，隨機(jī)等分為以下6組：正常組、牡荊素對照組、模型組、牡荊素低劑量組（0.3 mg/kg）、中劑量組（1 mg/kg）、高劑量組 （3 mg/kg）。參照文獻(xiàn)及預(yù)實驗結(jié)果復(fù)制急性肺損傷小鼠 （7 mg/kg LPS腹腔注入［7］）的動物模型。藥物組于注入LPS 30 min后腹腔注射牡荊素，模型組注入LPS 30 min后腹腔注射等量生理鹽水。正常組和牡荊素對照組在注入等量生理鹽水30 min后分別腹腔注射等量生理鹽水和牡荊素（3 mg/kg）。6 h后斷頸處死小鼠。

1.3 一般情況觀察 成功造模分組后每小時觀察動物的精神、體溫、飲食、呼吸、活動等情況。

1.4 肺組織病理學(xué)檢測 取小鼠左肺下葉肺組織固定于體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液中，組織石蠟包埋，切片HE染色，光鏡下觀察肺組織病理情況，并參照Kendra半定量評分標(biāo)準(zhǔn)［8］對組織損傷進(jìn)行評分。

1.5 肺濕質(zhì)量/干質(zhì)量比（W/D）測定 開胸分離肺組織，左肺上葉稱定質(zhì)量后，置烤箱 （80℃，20 h）烤至恒定質(zhì)量，稱干質(zhì)量，計算W/D。

1.6 BCA法檢測肺泡灌洗液中總蛋白水平 造模6 h后處死小鼠，消毒頸部皮膚后，剪開皮膚、分離氣管，將消毒后的導(dǎo)管插入氣管遠(yuǎn)心端，預(yù)冷的生理鹽水1 mL灌洗氣管2次，每次停留約30 s，回收灌洗液約1.5 mL，離心后取上清液，按說明書操作。

1.7 ELISA法檢測肺組織中TNF-α水平 取右肺中葉肺組織，用PBS液作為勻漿介質(zhì)，破碎肺組織后，離心取上清液，按試劑盒說明書步驟操作，在酶標(biāo)儀450 nm處測定吸光度，計算每個樣本的TNF-α的水平。

1.8 比色法測定肺組織中SOD、MDA水平 右肺中葉組織勻漿，取上清液，按試劑盒說明書步驟，在酶標(biāo)儀490 nm處測定吸光度，計算每個樣本的SOD、MDA的水平。

1.9 半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測NF-κBp65 mRNA的表達(dá) 提取肺組織總RNA后，按照試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，后擴(kuò)增PCR。NF-κBp65引物序列：正向為5′-TGCGATTCCGCTATAAATGCG-3′，反向為5′-ACAAGTTCATGTGGATGAGGC-3′，擴(kuò)增片段長度178 bp。β-actin引物序列：正向為5′-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3′，反向為5′-ATGTCACGCACGATTTCCC-3′，擴(kuò)增片段長度260 bp。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min后，按95℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，72℃10 min，循環(huán)35次，最后10℃cycle。瓊脂糖凝膠電泳后，Image-J軟件分析并拍攝圖像，NF-κBp65表達(dá)水平以其與β-actin的相對表達(dá)量計算。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用Spass 17軟件進(jìn)行多個樣本均數(shù)比較的方差分析，采用Bonferroni法進(jìn)行組間比較，P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況觀察 模型組小鼠在LPS腹腔注射2 h后，開始出現(xiàn)行動遲緩、萎靡不振，相互聚集，很少進(jìn)食，6 h后行動更加遲緩，用手觸碰也懶于活動，毛發(fā)雜亂、無光澤，并有明顯的豎立現(xiàn)象，分泌物增多，但仍然存活。藥物治療組小鼠約3 h開始出現(xiàn)聚集、依偎，行動減少。

2.2 肺組織中TNF-α、MDA水平和SOD活性變化

與正常組相比，模型組小鼠肺組織中TNF-α、MDA水平顯著升高，牡荊素低、中、高劑量組均能降低LPS所致肺損傷小鼠肺組織體內(nèi)TNF-α、MDA水平 （P＜0.05）。與正常組相比，模型組小鼠肺組織中SOD活性明顯降低，藥物中、高劑量組小鼠體內(nèi)SOD活力升高 （P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠肺組織中TNF-α、MDA水平和SOD活性(n=6,x±s)Tab.1 Levels of TNF-α,IL-10,MDA,SOD activity inlung tissue in each group(n=6,x±s)

2.3 肺泡灌洗液中總蛋白含有量變化和肺濕質(zhì)量/干質(zhì)量

腹腔注射LPS 6 h后，模型組小鼠總蛋白含有量較正常組明顯升高。牡荊素低、中、高劑量組總蛋白含有量較模型組有明顯降低 （P＜0.05）。與正常組相比，模型組肺組織W/D明顯升高 （P＜0.05），牡荊素中、高劑量組與模型組比較，W/D比值明顯降低 （P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠肺泡灌洗液中總蛋白含有量、W/D、病理評分(n=6,x±s)Tab.2 Contents of total protein in alveolar lavage in eachgroup(n=6,x±s)

2.4 肺組織病理變化 正常組和牡荊素對照組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁無增厚，肺泡腔內(nèi)無中性粒細(xì)胞大量滲出，無充血水腫；模型組肺組織結(jié)構(gòu)破壞，肺泡充血水腫明顯，部分可見出血，大量中性粒細(xì)胞滲出；牡荊素低、中、高劑量組肺損傷較模型組均有一定程度減輕，以高劑量組明顯，表現(xiàn)為肺組織充血水腫減輕，無出血，肺泡壁增厚減輕，炎性細(xì)胞浸潤有所減少。見圖1。與正常組相比，模型組肺組織病理學(xué)評分明顯增加 （P＜0.05），牡荊素低、中、高劑量組干預(yù)后肺組織病理學(xué)評分明顯降低 （P＜0.05）。見表2。

圖1 光鏡下各組小鼠肺病理學(xué)改變 (HE x 400)Fig.1 Lung pathology changes in each group by lightm icroscopy(HE x 400)

2.5 肺組織中NF-κBp65 mRNA的表達(dá) 與正常組對比，模型組NF-κBp65 mRNA表達(dá)水平明顯升高 （P＜0.05），牡荊素低、中、高劑量與模型組對比，NF-κBp65 mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見表3，圖2。

表3 各組小鼠肺組織中NF-κBp65 m RNA表達(dá)的相對值(n=6,x±s)Tab.3 Effects of vitexin on LPS-induced lung W/D(n= 6,x±s)

圖2 RT-PCR檢測NF-κBp65mRNA表達(dá)的電泳圖Fig.2 E lectrophoregram of NF-κBp65 m RNA expression by RT-PCR detection

3 討論

小鼠LPS腹腔內(nèi)注射為經(jīng)典的誘導(dǎo)急性肺損傷的造模方法［9］。在本實驗中，模型組小鼠呼吸窘迫、毛發(fā)豎立、腹瀉、相互偎依，W/D增高，肺泡灌洗液總蛋白含有量升高，肺組織中炎癥介質(zhì)如TNF-α、MDA水平升高，病理切片可見明顯肺泡上皮-毛細(xì)血管屏障破壞，炎癥細(xì)胞大量聚集，表明急性肺損傷模型制備成功。

LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷的本質(zhì)是過度失控的炎癥反應(yīng)。TNF-α作為啟動急性肺損傷重要的細(xì)胞因子，可直接觸發(fā)中性粒細(xì)胞的激活，釋放細(xì)胞毒性介質(zhì)，加重肺損傷。本實驗中，模型組小鼠炎癥介質(zhì)TNF-α升高，牡荊素低、中、高劑量組TNF-α水平明顯低于模型組，且呈劑量依賴性，說明牡荊素能通過抑制TNF-α的產(chǎn)生而達(dá)到保護(hù)肺組織的目的。

急性肺損傷時，體內(nèi)氧化/抗氧化平衡失調(diào)，引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生劇烈氧化應(yīng)激反應(yīng)，加重肺損傷。MDA能間接判斷細(xì)胞膜受損嚴(yán)重程度，SOD是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，能間接反映機(jī)體內(nèi)清除氧自由基的能力［10］。本實驗發(fā)現(xiàn)，牡荊素中、高劑量組均能降低肺損傷時MDA水平，改善SOD活力。由此推測，牡荊素可以通過抑制急性肺損傷時肺組織細(xì)胞膜的過氧化，從而減輕肺損傷。

腹腔注射LPS 6 h后，模型組小鼠肺組織切片提示肺泡充血水腫明顯，肺泡間隔增寬，炎癥細(xì)胞浸潤，而牡荊素組肺組織損傷較模型組明顯減輕，且與劑量相關(guān)。肺損傷時內(nèi)皮細(xì)胞-毛細(xì)血管膜完整性缺失，通透性增加，富含蛋白的滲出液充斥在肺泡及間質(zhì)中［11］。本實驗中發(fā)現(xiàn)模型組與正常組比較，W/D明顯升高，蛋白濃度增加，而經(jīng)過牡荊素干預(yù)的小鼠，上述數(shù)值均有所降低，以牡荊素中、高劑量表現(xiàn)明顯，表明牡荊素能降低LPS引發(fā)的肺組織通透性的升高。

P50和p65組建的異源二聚體構(gòu)成了典型的NF-κB，NF-κB作為快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，存在于胞漿中，在體內(nèi)刺激因素（如LPS）存在時，NF-κB活性狀態(tài)發(fā)生改變，迅速轉(zhuǎn)入細(xì)胞核中，調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)基因的表達(dá)，促進(jìn)炎性反應(yīng)失控，導(dǎo)致肺損傷的發(fā)生及發(fā)展。本實驗中，藥物干預(yù)組NF-κBp65的表達(dá)比模型組弱，這提示可能與牡荊素通過抑制NF-κBp65 mRNA的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，牡荊素能通過抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低肺組織的通透性，從而使肺組織損傷減少，這可能與牡荊素能抑制NF-κBp65 mRNA的表達(dá)有關(guān)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

［1］Ware L B.Pathogenesis of acutemicrovascular lung injury and the acute respiratory distress syndrome［J］.Semin Respir Crit Care Med，2002，27（4）：337-349.

［2］ChoiH J，Eun JS，Kim BG，etal.Vitexin，an HIF-1alpha inhibitor，has anti-metastatic potential in PC12 cells［J］.Mol Cells，2006，22（3）：291-299.

［3］Tan Z，Zhang Y，Deng J，et al.Purified vitexin compound 1 suppresses tumor growth and induces cell apoptosis in a mouse model of human choriocarcinoma［J］.Int J Gynecol Cancer，2012，22（3）：360-366.

［4］Yang SH，Liao PH，Pan Y F，etal.The novel p53-dependentmetastatic and apoptotic pathway induced by vitexin in human oral cancer OC2 cells［J］.Phytother Res，2013，27（8）：1154-1161.

［5］Cao D D，Li H，Yi JY，et al.Antioxidant properties of the mung bean flavonoids on alleviating heat stress［J］.PLoSOne，2011，6（6）：1-8.

［6］de Melo G O，Muzitano M F，Legora-Machado A，et al.C-glycosylflavones from the aerial parts of Eleusine indica inhibit LPS-induced mouse lung inflammation［J］.Planta Med，2005，71（4）：362-363.

［7］梁錦屏，王琳琳，黃 菱，等.內(nèi)毒素血癥小鼠肺組織損傷及血清炎癥因子變化的研究［J］.寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，32（8）：852-855.

［8］Elia N，Tapponnier M，Matthay M A.Functional identification of the alveolar edema reabsorption activity ofmurine tumor necrosis factor-α［J］.Am JRespair CritCareMed，2003，168（9）：1043-1050.

［9］陳 嬌，錢曉明，聶時南.急性肺損傷動物模型的研究現(xiàn)狀［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2013，26（8）：851-854.

［10］楊翠萍，楊曉金，田真真，等.槐定堿對急性肺損傷小鼠肺組織SOD，MDA及TLR4表達(dá)的影響［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18（14）：180-183.

［11］Johnson ER，Matthay M A.Lung injury：Epidemiology，pathogenesis，and treatment［J］.J Aerosol Med Pulm Drug Deliv，2010，23（4）：243-252.

Protective effect of vitexin on m ice w ith acute lung injury

LUO Li， JIANG Tao*， CHEN Nie
（Department of Respiratory Medicine，The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

AIMTo study the protective effect of vitexin on male C57BL/6 mice with acute lung injury.METHODSLipopolysaccharide（LPS，7 mg/kg）was injected through the abdominal cavity to inducemice with acute lung injury.Seventy-twomoldedmice were randomly divided into six groups：the normal group，vitexin control group，themodel group，vitexin low，middle，and high dose groups.The general conditionswere observed for all experimentalmice.The ratio ofwet to dry weight lung tissue（W/D）and the levels of tumor necrosis factor alpha（TNF-α），superoxide dismutase（SOD），malondialdehyde（MDA）in lung tissues were determined in six hours.The levels of total protein in alveolar lavage fluid were detected.The histopathological changes of lung tissueswere observed under lightmicroscope.The expressions of NF-κBp65 mRNA were measured.RESULTSCompared with themodel group，vitexin groups significantly decreased the levels of TNF-αand MDA in lung tissues and the total protein level in alveolar lavage fluid while increased the contents of SOD，reduced lungwet/dry weight ratio，attenuated pathological changes of lung tissues，and suppressed the expression of NF-κBp65 mRNA in a dose-dependentmanner（P＜0.05）.CONCLUSIONVitexin has protective effecton mice with acute lung injury through anti-inflammatory and antioxidant route.

viexin；acute lung injury；lipopolysaccharide

R966

：A

：1001-1528（2015）07-1393-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.001

2014-12-15

羅 麗 （1982—），女，碩士生，主治醫(yī)師，研究方向為肺損傷治療。Tel：18202354978，E-mail：826333463@qq.com

*通信作者：江 濤，女，教授，研究方向為肺損傷、肺纖維化的治療。Tel：13996122790，E-mail：j.tcq@163.com