桂 春， 黃 靜， 程佩佩， 方 玉， 夏 葉， 張秀橋

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北武漢430000）

篩選大葉蛇葡萄體外抗腫瘤活性物質(zhì)

桂 春， 黃 靜， 程佩佩， 方 玉， 夏 葉， 張秀橋*

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北武漢430000）

目的研究大葉蛇葡萄提取物對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響，篩選有效抗腫瘤活性物質(zhì)。方法采用MTT法檢測(cè)不同質(zhì)量濃度的大葉蛇葡萄石油醚、乙酸乙酯及水層萃取物和蛇葡萄素、楊梅素、楊梅苷、槲皮素及槲皮苷分別作用于HeLa細(xì)胞24、48、72 h后對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。流式細(xì)胞儀檢測(cè)蛇葡萄素對(duì)細(xì)胞周期的影響。結(jié)果乙酸乙酯萃取物、蛇葡萄素和楊梅素均有不同程度抑制HeLa細(xì)胞增殖的作用，且在一定劑量范圍內(nèi)，具有時(shí)效或量效關(guān)系；碘化丙啶單染法顯示蛇葡萄素作用HeLa細(xì)胞12 h，G0/G1期細(xì)胞比率降低，S期細(xì)胞比率增加。結(jié)論乙酸乙酯提取物、蛇葡萄素和楊梅素對(duì)HeLa細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，且蛇葡萄素可能通過阻滯HeLa細(xì)胞于S期而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

大葉蛇葡萄；蛇葡萄素；楊梅素；抗腫瘤；HeLa細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期

大葉蛇葡萄Ampelopsismegalophylla Diels et. Gilg是葡萄科蛇葡萄屬植物，湖北西部地區(qū)民間常用中草藥。其藥用部位是葉及嫩莖，因其嫩枝葉置沸水中稍燙后，撈起后通風(fēng)處吹干，表面會(huì)出現(xiàn)星點(diǎn)白霜，故又稱為霉茶［1］。該藥曾收載于 《湖北中草藥志》［2］，性平，味酸、澀，具有活血散瘀、止血、清熱解毒等功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有降血脂、降血糖、降血壓、抗病毒等［3-7］作用，但未見其對(duì)抗腫瘤作用的研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用MTT［8-10］法觀察大葉蛇葡萄3種不同提取物對(duì)HeLa細(xì)胞增殖抑制情況，分析不同提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示乙酸乙酯萃取物對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖有較好的抑制作用，進(jìn)而將從乙酸乙酯萃取物分離得到的蛇葡萄素等5種化合物分別采用MTT法觀察其對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制作用，并將抑制作用最強(qiáng)的蛇葡萄素進(jìn)行細(xì)胞周期分布的研究，初步探討其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 材料

1.1.1 藥品和細(xì)胞株 大葉蛇葡萄采于湖北省恩施州來鳳縣，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室張秀橋教授鑒定為葡萄科蛇葡萄屬植物大葉蛇葡萄Ampelopsismegalophylla Diels et.Gilg，取其葉及嫩莖為實(shí)驗(yàn)材料。實(shí)驗(yàn)所用宮頸癌細(xì)胞HeLa購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，在武漢大學(xué)藥學(xué)院細(xì)胞室傳代備用。

1.1.2 試劑 四甲基偶氮唑鹽粉末（MTT，美國Amresco公司），DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS）、青霉素-鏈霉素 （雙抗）、胰蛋白酶 （美國Thermo公司），小牛血清 （NBS，杭州四季青生物工程材料有限公司），二甲基亞砜 （DMSO）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）粉末（美國Sigma公司）。

1.1.3 大葉蛇葡萄提取物的分離與溶液制備 稱取大葉蛇葡萄藥材8.5 kg，粉碎，過10目篩，分別以10倍量95%和75%乙醇各滲漉提取一次 （浸泡24 h，體積流量10 mL/min），合并提取液，減壓回收乙醇并濃縮至小體積得乙醇提取物；加適量水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯和水進(jìn)行萃取，分別合并3種不同萃取液，最后依次濃縮干燥得到石油醚、乙酸乙酯及水層提取物。取乙酸乙酯提取物200 g采用硅膠柱、Sephadex LH-20柱色譜等技術(shù)分離純化，分別得到蛇葡萄素、楊梅素、楊梅苷、槲皮素和槲皮苷。稱取適量的提取物，用DMSO配成適當(dāng)濃度的供試液，4℃冰箱保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)用培養(yǎng)基稀釋成所需藥物濃度，提取物質(zhì)量濃度分別為12.5、25、50、100、200μg/mL，單體的摩爾濃度為20、40、80、160、320μmol/L。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 Galaxy s+CO2培養(yǎng)箱（英國RSBiotech公司）；ClassⅡtype A2超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；IX51Olympus倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；HEV-50自動(dòng)高壓滅菌器（日本Hirayama公司）；iMark酶標(biāo)儀（美國Bio-RAD公司）；TDZ4-WS臺(tái)式自動(dòng)平衡離心機(jī) （長沙平凡儀器儀表有限公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；BCD-188C冰箱（合肥美菱股份有限公司）；WG-136電熱鼓風(fēng)干燥箱 （天津市泰斯特儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HeLa細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長，用0.25%的胰酶消化傳代，用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長期。

2.2 MTT法測(cè)定HeLa細(xì)胞的生長抑制率 選擇處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)為5×103個(gè)/mL接種于96孔板，每孔100μL，然后將培養(yǎng)板置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中24 h后，吸取舊培養(yǎng)液，每孔加入100μL的藥液，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置空白對(duì)照組（含細(xì)胞、培養(yǎng)基及溶劑）和調(diào)零組 （含培養(yǎng)基和溶劑）。分別在培養(yǎng)箱溫孵24、48、72 h后，每孔加入20μLMTT溶液，繼續(xù)放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。4 h后吸去上清液，加入100μL的DMSO，放置于搖床上低速振蕩至每孔中結(jié)晶物完全溶解。在酶標(biāo)儀490 nm波長處測(cè)量各孔吸光度（OD）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

2.3 PI單染法檢測(cè)HeLa細(xì)胞周期 選擇對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)為2×105個(gè)/mL接種于6孔板，每孔2 mL。培養(yǎng)24 h后，分別加入 0、30、40、50、60、70 μmol/L的蛇葡萄素藥液，12 h后收集細(xì)胞。離心后用預(yù)冷的PBS洗滌2次后，加入75%乙醇放置-20℃環(huán)境固定過夜，離心后PBS洗滌2次，加入30μL 1 mg/mL RnaseA，37℃作用30 min，加入50μg/m L的PI溶液，4℃避光染色30 min用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，細(xì)胞周期擬和軟件分析結(jié)果［11-13］。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果用x±s表示，與對(duì)照組比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)計(jì)算半數(shù)抑制率 （IC50）值。

3 結(jié)果及分析

3.1 提取物對(duì)HeLa細(xì)胞的生長抑制作用 一定濃度范圍內(nèi)，3種提取物分別作用于HeLa細(xì)胞24、48和72 h。結(jié)果顯示當(dāng)藥物作用時(shí)間為48 h時(shí)，在25～200μg/mL范圍內(nèi)，石油醚提取物對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制作用隨質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)，表現(xiàn)劑量依賴性；當(dāng)藥物作用時(shí)間為72 h時(shí)，在12.5～200μg/mL范圍內(nèi)，石油醚提取物對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制作用隨質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)，表現(xiàn)劑量依賴性。如圖1A所示。當(dāng)藥物作用時(shí)間為48 h時(shí)，在12.5～200μg/mL范圍內(nèi)，乙酸乙酯提取物對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制作用隨質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)，表現(xiàn)劑量依賴性；當(dāng)藥物質(zhì)量濃度為50μg/mL時(shí)，乙酸乙酯提取物對(duì)HeLa細(xì)胞的作用隨時(shí)間的延長而減弱，表現(xiàn)時(shí)間依賴性，即當(dāng)藥物作用時(shí)間為24 h，抑制作用最強(qiáng)。結(jié)果見圖1B。HeLa細(xì)胞對(duì)水層提取物不敏感，結(jié)果見圖1C。

圖1 石油醚、乙酸乙酯、水層提取物對(duì)HeLa細(xì)胞抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of ether,EtOAc,aqueous extract on cell proliferation in HeLa

3.2 單體化合物對(duì)HeLa細(xì)胞的生長抑制作用

一定濃度范圍內(nèi)，5種化合物分別作用于HeLa細(xì)胞24、48和72 h后，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用結(jié)果如圖2～6所示。

圖2 蛇葡萄素對(duì)HeLa細(xì)胞抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of am pelopsin on cell proliferation in HeLa

圖3 楊梅素對(duì)HeLa細(xì)胞抑制作用Fig.3 Inhibitory effect ofm yricetin on cell proliferation in HeLa

圖4 楊梅苷對(duì)HeLa細(xì)胞抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of m yricetrin on cell proliferation in HeLa

圖5 槲皮素對(duì)HeLa細(xì)胞抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of quercetin on cell p roliferation in HeLa

圖6 槲皮苷對(duì)HeLa細(xì)胞抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of quercetrin on cell proliferation in HeLa

當(dāng)藥物作用48 h，在20～320μmol/L范圍內(nèi)，蛇葡萄素對(duì)細(xì)胞的抑制作用隨濃度的升高而增強(qiáng)，表現(xiàn)劑量依賴性；當(dāng)藥物作用72 h，在40～320μmol/L范圍內(nèi)，蛇葡萄素對(duì)細(xì)胞的抑制作用隨劑量的升高而增強(qiáng)，表現(xiàn)劑量依賴性；當(dāng)藥物濃度分別為80、160和320μmol/L時(shí)，蛇葡萄素對(duì)He-La細(xì)胞增殖的抑制作用均隨時(shí)間的延長而增強(qiáng)，分別表現(xiàn)時(shí)間依賴性；即當(dāng)藥物作用時(shí)間為72 h時(shí)，蛇葡萄素對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用最強(qiáng)，如圖2所示。經(jīng)計(jì)算得蛇葡萄素作用HeLa細(xì)胞24、48和72 h的 IC50分別為105.30、90.55和65.58μmol/L。

當(dāng)藥物作用48 h，在40～320μmol/L范圍內(nèi)，楊梅素對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制作用隨濃度的升高而增強(qiáng)，表現(xiàn)劑量依賴性；當(dāng)藥物濃度分別為80、160和320μmol/L時(shí)，楊梅素對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用均隨時(shí)間的延長而增強(qiáng)，表現(xiàn)時(shí)間依賴性；即當(dāng)藥物作用時(shí)間為72 h時(shí)，楊梅素對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用最強(qiáng)，如圖3所示。計(jì)算得楊梅素作用HeLa細(xì)胞24、48和72 h的IC50分別為108.15、93.06和85.44μmol/L。

由圖4可知，當(dāng)藥物作用48或72 h，在20～160μmol/L范圍內(nèi)，楊梅苷對(duì)HeLa細(xì)胞幾乎無抑制作用，當(dāng)藥物劑量逐漸升高至320μmol/L過程呈現(xiàn)一定的抑制作用。

當(dāng)藥物作用24或48 h，在40～320μmol/L范圍內(nèi)，槲皮素對(duì)細(xì)胞的抑制作用隨濃度的增高而增強(qiáng)，表現(xiàn)劑量依賴性；當(dāng)藥物作用72 h，在20～320μmol/L范圍內(nèi)，槲皮素對(duì)細(xì)胞的抑制作用隨濃度量的增高而增強(qiáng)，表現(xiàn)時(shí)間依賴性；如圖5所示。經(jīng)計(jì)算得槲皮素作用HeLa細(xì)胞48和72 h的IC50分別為229.38和158.9μmol/L。

由圖6可知，HeLa細(xì)胞對(duì)槲皮苷不敏感。

3.3 蛇葡萄素對(duì)HeLa細(xì)胞周期分布的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度的蛇葡萄素作用HeLa細(xì)胞的DNA水平揭示了HeLa細(xì)胞周期分布的變化。如圖7所示，與空白對(duì)照組對(duì)照可知，G0/G1期，給藥組的DNA水平隨著藥物劑量的升高逐漸降低；S期，給藥組的DNA水平呈現(xiàn)升高趨勢(shì)；G2/M期，在30～60μmol/L范圍內(nèi)，給藥組DNA水平隨著藥物劑量的升高逐漸增大，當(dāng)濃度為70μmol/L，DNA水平減小。由此可知，高濃度時(shí)細(xì)胞凋亡較多，蛇葡萄素可能造成HeLa細(xì)胞S期阻滯，從而影響細(xì)胞周期正常進(jìn)行。

4 討論

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一［14］，在全球女性腫瘤中發(fā)病率僅次于乳腺癌［15］，它的發(fā)病和死亡的85%以上是在發(fā)展中國家［16］。作為發(fā)展中國家，2010年我國宮頸癌病例 27 000～130 000例，若沒有進(jìn)行任何干預(yù)措施，到2050年可能增加到42 000～187 000例［17］。由此可見，對(duì)宮頸癌的有效治療對(duì)女性健康的必要性和重要性。隨著現(xiàn)代社會(huì)的腫瘤患者的增多，西藥治療療效相對(duì)明顯，但伴隨毒副作用，且久用會(huì)產(chǎn)生耐藥性，而人們對(duì)身體的重視程度卻在不斷提高。我國中藥資源豐富，種類繁多，在治療腫瘤方面積累了寶貴的經(jīng)驗(yàn)，因此從中篩選出高效低毒的抗宮頸癌藥物具有廣闊前景。

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)此問題，選取宮勁癌HeLa細(xì)胞對(duì)大葉蛇葡萄的抗腫瘤活性進(jìn)行了系列研究。根據(jù)圖1比較可知，水層提取物對(duì)HeLa細(xì)胞幾乎無抑制作用，其他兩種提取物在一定劑量、時(shí)間范圍內(nèi)都表現(xiàn)相對(duì)的抑制作用。

當(dāng)藥物作用時(shí)間為24 h時(shí)，在12.5～200 μg/mL范圍內(nèi)，石油醚提取物對(duì)HeLa細(xì)胞無抑制作用，乙酸乙酯提取物對(duì)HeLa細(xì)胞抑制作用呈加強(qiáng)趨勢(shì)，且抑制作用較強(qiáng)；當(dāng)藥物作用時(shí)間為48或72 h時(shí)，石油醚提取物對(duì)HeLa細(xì)胞抑制作用隨劑量的升高而加強(qiáng)，但只在最高劑量時(shí)抑制率達(dá)到半數(shù)抑制率，而乙酸乙酯提取物對(duì)HeLa細(xì)胞抑制作用隨劑量的升高而加強(qiáng)，且抑制作用最高達(dá)90.65%。

圖7 蛇葡萄素對(duì)HeLa細(xì)胞周期分布的影響Fig.7 Effect of ampelopsin on cell cycle distribution in HeLa

當(dāng)藥物質(zhì)量濃度為25μg/mL時(shí)，乙酸乙酯提取物對(duì)HeLa細(xì)胞作用24 h時(shí)的抑制作用明顯強(qiáng)于石油醚提取物，且抑制率為68.20%；當(dāng)藥物質(zhì)量濃度為50μg/m L時(shí)，乙酸乙酯提取物對(duì)HeLa細(xì)胞作用24 h的抑制作用亦明顯高于石油醚提取物，抑制率為73.64%；由此可見，3種提取物中，乙酸乙酯提取物對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，且通過計(jì)算最強(qiáng)IC50為28.55μg/mL。

根據(jù)圖7可知，HeLa細(xì)胞對(duì)槲皮苷不敏感，楊梅苷與槲皮素在高濃度時(shí)表現(xiàn)一定的抑制作用，相比較可知蛇葡萄素與楊梅素對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制作用較強(qiáng)，且在一定的劑量、時(shí)間范圍內(nèi)呈現(xiàn)時(shí)間-劑量效應(yīng)關(guān)系。

當(dāng)藥物作用時(shí)間為72 h，蛇葡萄素和楊梅素均得到最低IC50值，分別為65.58和85.44μmol/L。當(dāng)藥物濃度為40μmol/L時(shí)，蛇葡萄素對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制率為20.96%，而楊梅素對(duì)HeLa細(xì)胞生長表現(xiàn)促進(jìn)作用；當(dāng)藥物濃度為80μmol/L時(shí)，蛇葡萄素和楊梅素對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制率分別為84.53和61.15%，前者抑制作用強(qiáng)于后者；當(dāng)藥物濃度繼續(xù)升高，此兩種藥物對(duì)HeLa細(xì)胞生長的抑制作用變化不明顯。由此可見，5種化合物中，蛇葡萄素對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，且通過計(jì)算最強(qiáng)的IC50為65.58μmol/L。

本研究中首先對(duì)大葉蛇葡萄的3種提取物進(jìn)行抗宮頸癌的活性篩選，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯提取物具有較強(qiáng)的抑制作用，且在一定劑量、時(shí)間范圍內(nèi)，有良好的時(shí)間-劑量效應(yīng)關(guān)系。進(jìn)一步對(duì)從乙酸乙酯提取物分離得到的五種單體同樣進(jìn)行了抗宮頸癌活性篩選，發(fā)現(xiàn)蛇葡萄素與楊梅素對(duì)HeLa細(xì)胞增殖有較強(qiáng)的抑制作用，最小IC50分別為65.58和85.44 μmol/L，因蛇葡萄素作為大葉蛇葡萄含有量最高的主要活性成分，且對(duì)HeLa細(xì)胞的IC50小于楊梅素，故選取蛇葡萄素作為代表物質(zhì)進(jìn)行下一步的細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)表明，結(jié)果表明蛇葡萄素可能通過阻滯HeLa細(xì)胞于S期而誘導(dǎo)其凋亡，該研究為后期大葉蛇葡萄抗腫瘤作用機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為研制抗宮頸癌現(xiàn)代新藥提供了新方向。

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Screen of anti-tumor active substances in vitro from Ampelopsismegalophylla

GUIChun， HUANG Jing， CHENG Pei-pei， FANG Yu， XIA Ye， ZHANG Xiu-qiao*
（School of Pharmaceutical Sciences，Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430065，PR China）

AIMTo investigate the inhibitory effect of extracts from Ampelopsismegalophylla on the proliferation of HeLa cells and to screen the anti-tumor activity in vitro.METHODSHeLa cellswere treated with ether，EtOAc and aqueous extracts of A.megalophylla as well as five compounds，ampelopsin，myricetin，myricetrin，quercetin and quercetrin，with various concentrations，respectively.MTTmethod was used to evaluate the inhibitory efficiency in 24 h，48 h and 72 h，respectively.Flow cytometry PIwas used tomeasure their changes of cell cycle under the condition of ampelopsin.RESULTSExperimental data showed EtOAc extract，ampelopsin and myricetin all inhibited the cell proliferation in a dose-effector time-effect relationship within a certain concentration range.Propidium iodide（PI）stainingmethod indicated that there were less cells at G0/G1stage andmore cells arrested at S stagewhen incubated with ampelopsin.CONCLUSIONEtOAc extract of A.megalophylla，ampelopsin andmyricetin can inhibit the human cervical cancer cell line HeLa in vitro by inhibiting cellproliferation.Maybe ampelopsin induces cell apoptosis by arresting cells at Sphase.

Ampelopsismegalophylla；ampelopsin；myricetin；anti-tumor；HeLa cells；cell proliferation；cell cycle

R285.5

：A

：1001-1528（2015）07-1411-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.005

2014-08-18

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （31170335）；武漢市重點(diǎn)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目 （201160823265）

桂 春 （1989—），女，碩士，從事中藥資源、品質(zhì)及開發(fā)研究。Tel：15927207749，E-mail：gc19890703@163.com

*通信作者：張秀橋 （1965—），女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥資源、品質(zhì)及開發(fā)研究。Tel：13871392318，E-mail：qiaoxzh2000@163.com