高倩倩， 顏翠萍， 翁澤斌， 趙根華， 陳志鵬， 蔡寶昌， 李偉東*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥炮制重點實驗室國家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心，江蘇南京210046，2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210046，3.濟川藥業(yè)集團股份有限公司，江蘇泰州225400）

補骨脂鹽炙前后含藥血清對人成骨細(xì)胞的影響

高倩倩1，2， 顏翠萍3， 翁澤斌1，2， 趙根華1，2， 陳志鵬1，2， 蔡寶昌1，2， 李偉東1，2*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥炮制重點實驗室國家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心，江蘇南京210046，2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210046，3.濟川藥業(yè)集團股份有限公司，江蘇泰州225400）

目的研究補骨脂鹽炙前后含藥血清對成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化的影響。方法采用從絕經(jīng)后婦女股骨松質(zhì)骨分離得到的成骨細(xì)胞，利用補骨脂生品和鹽炙品含藥血清干預(yù)，采用MTT法、堿性磷酸酶活性測定法、茜素紅染色法研究其對成骨細(xì)胞增殖、分化及礦化的影響。結(jié)果補骨脂生品和鹽炙品含藥血清均能促進人成骨細(xì)胞的增殖，提高堿性磷酸酶的活性，且血清體積分?jǐn)?shù)為20%時，補骨脂鹽炙品含藥血清對成骨細(xì)胞增殖、分化的促進作用顯著優(yōu)于生品（P＜0.01）；同時，補骨脂生品和鹽炙品含藥血清均能促進成骨細(xì)胞礦化的作用，且鹽炙品要優(yōu)于生品。結(jié)論補骨脂生品和鹽炙品含藥血清均具有良好的促進人成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化的作用，其中鹽炙品的作用顯著優(yōu)于生品。

補骨脂；鹽炙；成骨細(xì)胞；骨質(zhì)疏松癥

補骨脂為豆科植物補骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果實，性溫味辛，具有補腎助陽，溫中止瀉，納氣平喘的功效［1］。現(xiàn)代藥理研究表明，補骨脂具有明顯的抗骨質(zhì)疏松活性。近年來研究表明［2］，補骨脂水煎劑可改善去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝指標(biāo)和血清細(xì)胞因子水平。補骨脂炮制品主要有生品和鹽炙品兩種，藥物經(jīng)鹽炙后能增強其補腎健骨的作用。本研究采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和中藥血清藥理學(xué)方法，探討補骨脂鹽炙前后含藥血清對體外培養(yǎng)人成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化的影響。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 ZesisAxion A1倒置顯微鏡（德國Zesi公司）；CO2培養(yǎng)箱（德國MEMMERT INE600公司）；低速離心機 （湘儀離心機儀器公司）；Bio-Rad Model 550型酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥物與試劑 補骨脂生品 （批號110711，南京海源中藥飲片有限公司），經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定，為豆科植物補骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果實。α-MEM培養(yǎng)基 （批號SH30265，美國Hy-Clone公司）；胎牛血清 （批號1527494，美國Gibco公司）；青/鏈霉素溶液 （批號15140-122，美國Gibco公司）；胰蛋白酶 （批號25200-056，美國 Gibco公司）；MTT（批號BS030A，中國Biosharp公司）；堿性磷酸酶試劑盒（批號P0321，碧云天生物技術(shù)研究所）；細(xì)胞鈣茜素紅染色試劑盒 （批號GMS80046.3，上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司）。

1.3 動物 SPF級雌性SD大鼠30只，體質(zhì)量250～300 g，由浙江省實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK（浙）2014-0001。飼養(yǎng)條件：室溫（23±2）℃，相對濕度 （60±5）%，12 h光照，標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

2 實驗方法

2.1 樣品制備

2.1.1 鹽補骨脂的制備 根據(jù) 《中國藥典》2010年版一部附錄ⅡD鹽炙法自制。其炮制工藝為取補骨脂生品，加鹽水拌勻，悶潤透，置炒制容器內(nèi)，以文火加熱，炒至有香氣溢出，表面焦黃時，取出，放涼 （注：每100 kg補骨脂用食鹽2 kg）。

2.1.2 補骨脂水煎液的制備 取補骨脂生品和鹽炙品各50 g，置于砂鍋之中，精密加入水500 mL，武火煎煮至沸，文火煎煮20 min，煎煮2次，過濾，合并2次煎煮濾液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至0.2 g/mL，備用。

2.2 含藥血清的制備 30只大鼠隨機分為3組：空白組、補骨脂組和鹽補骨脂組。每天分別灌胃給補骨脂生品以及鹽炙品的水提液 （2 mL/200 g），空白組口服給生理鹽水。連續(xù)給藥7 d，第7天灌胃給藥1 h后，所有大鼠，心臟插管取血，室溫下靜置1 h，3 600 r/min離心10 min，取血清。所收集的血清于56℃滅活30 min，過濾除菌后保存于-80℃，備用。

2.3 成骨細(xì)胞的培養(yǎng)［3-4］絕經(jīng)后婦女松質(zhì)骨組織由江蘇省中醫(yī)院骨科提供，無菌條件取出絕經(jīng)后婦女股骨松質(zhì)骨組織 （術(shù)前經(jīng)患者同意，并得到南京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)），PBS沖洗3遍。剪成1 mm3左右小粒。用PBS反復(fù)沖洗至小骨粒發(fā)白，移入培養(yǎng)皿 （瓶）中，加入0.25%胰蛋白酶消化1 h，血清終止消化，棄上清。加入含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，靜置數(shù)天，待細(xì)胞從骨粒邊長出后換培養(yǎng)液并棄骨粒。2～3 d換液一次，細(xì)胞匯合鋪滿細(xì)胞瓶后，使用胰蛋白酶消化，1∶3傳代培養(yǎng)，實驗均采用P3代細(xì)胞。

2.4 細(xì)胞增殖率測定［5-6］P3代細(xì)胞按104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL，37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，棄去原培養(yǎng)液，換無血清培養(yǎng)液，饑餓細(xì)胞24 h，棄去無血清培養(yǎng)液，向96孔板中加入各組不同體積分?jǐn)?shù)含藥血清培養(yǎng)液 （5%，10%，20%）和空白血清培養(yǎng)液，以含10%胎牛血清的培養(yǎng)液為空白對照，每藥重復(fù)6個孔。分別于48 h后，棄去培養(yǎng)液，加入MTT液（5 mg/mL）20μL/孔，37℃孵育4 h，棄去孔內(nèi)上清液，加入150μL DMSO/孔，搖床震蕩10 min，用酶標(biāo)儀選擇在490 nm處，測定各孔吸光度值。細(xì)胞增殖率的計算如下：

增殖率%=［（OD樣品-OD空白）/（OD對照-OD空白）-1］×100%

2.5 堿性磷酸酶活性測定［7］P3代細(xì)胞按105個/孔接種于24孔板中，每孔400μL，37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，棄去原培養(yǎng)液，換無血清培養(yǎng)液，饑餓細(xì)胞24 h，棄去無血清培養(yǎng)液，向24孔板中加入各組不同體積分?jǐn)?shù)含藥血清培養(yǎng)液 （5%，10%，20%）和空白血清培養(yǎng)液，以含10%胎牛血清的培養(yǎng)液為對照，每藥重復(fù)6個孔，每孔400μL，培養(yǎng)72 h后，取含藥培養(yǎng)液20μL，按照堿性磷酸酶試劑盒操作方法，顯色后在405 nm波長下測定各孔吸光度值，根據(jù)試劑盒說明分別計算堿性磷酸酶活性。

2.6 礦化結(jié)節(jié)鈣茜素紅染色［8］P3代細(xì)胞按2× 105個/孔接種于6孔板中，每孔2.0 mL，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，棄去原培養(yǎng)液，換無血清培養(yǎng)液，饑餓細(xì)胞24 h，棄去無血清培養(yǎng)液，向6孔板中加入各組不同體積分?jǐn)?shù)含藥血清培養(yǎng)液 （5%，10%，20%）和空白血清培養(yǎng)液，以含10%胎牛血清的培養(yǎng)液為對照，每藥重復(fù)3個孔，每孔2.0 mL，培養(yǎng)14 d后，按照細(xì)胞鈣茜素紅染色試劑盒操作方法，顯色后在倒置顯微鏡下拍片照相記錄。

2.7 統(tǒng)計學(xué)處理 所有實驗數(shù)據(jù)均以x±s表示，統(tǒng)計方法采用單因素方差分析 （ANOVA），用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計處理，以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.01為有顯著性差異，P＜0.001為有極顯著性差異。

3 實驗結(jié)果

3.1 不同時期細(xì)胞顯微鏡下形態(tài) 剛?cè)〕龅某晒羌?xì)胞呈球形，懸浮于培養(yǎng)液中并逐漸沉降貼壁，24 h存活細(xì)胞已完全貼壁展開 （圖1a）。展開后的細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，多呈三角形、多角形，有較多突起，單核呈卵圓形，1～3個核仁。生長期細(xì)胞突起相互聯(lián)接，匯合時細(xì)胞呈鋪石狀，并可重疊生長（圖1b）。重疊生長的細(xì)胞逐漸形成細(xì)胞小結(jié)，隨后膠原堆積及鈣鹽沉積，最后形成不透光礦化結(jié)節(jié)，茜素紅染色后呈現(xiàn)桔紅色 （圖1c）。

圖1 人成骨細(xì)胞的形態(tài)Fig.1 Phase-contrastm icroscopic appearance of human osteoblasts

3.2 鹽炙對補骨脂含藥血清干預(yù)人成骨細(xì)胞增殖活性的影響 MTT法分析補骨脂不同炮制品的含藥血清對人成骨細(xì)胞增殖活性的影響，表1顯示，補骨脂的生品及鹽炙品的含藥血清均具有促進成骨細(xì)胞增殖的作用，且血清體積分?jǐn)?shù)為20%時，補骨脂鹽炙品含藥血清促進成骨細(xì)胞增殖的作用顯著優(yōu)于生品含藥血清 （P＜0.01），因此補骨脂生品和鹽炙品含藥血清促進成骨細(xì)胞增殖作用最佳體積分?jǐn)?shù)為20%。實驗結(jié)果表明，鹽炙能夠增強補骨脂含藥血清促進成骨細(xì)胞增殖的作用。

表1 補骨脂不同炮制品含藥血清對成骨細(xì)胞增殖活性的影響 (x±s,n=4)Tab.1 Effects of the serum containing processed Buguzhion osteoblasts proliferation after treatment in 48 h(x±s,n=4)

3.3 鹽炙對補骨脂含藥血清的成骨細(xì)胞增殖活性的影響

3.3.1 ALP活性標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以酶活性（U/L）為橫坐標(biāo) （x），吸光度值為縱坐標(biāo) （y），建立回歸方程，得到回歸方程為y=0.094 5x-0.013 4（μ=0.999 5）。

3.3.2 鹽炙對補骨脂含藥血清的成骨細(xì)胞分化活性的影響 ALP活性測定法分析補骨脂不同炮制品的含藥血清對成骨細(xì)胞分化活性的影響，表2顯示，補骨脂的生品及鹽炙品的含藥血清均具有促進成骨細(xì)胞分化的作用，且血清體積分?jǐn)?shù)為10%、20%時，補骨脂鹽炙品含藥血清促進成骨細(xì)胞分化的作用顯著優(yōu)于生品含藥血清 （P＜0.01），補骨脂生品和鹽炙品含藥血清促進成骨細(xì)胞分化作用最佳體積分?jǐn)?shù)為20% （P＜0.001）。實驗結(jié)果表明，鹽炙能夠增強補骨脂含藥血清的促進成骨細(xì)胞分化的作用。

3.4 鹽炙對補骨脂含藥血清的成骨細(xì)胞礦化活性的影響 人成骨細(xì)胞加入空白血清和含藥血清后繼續(xù)培養(yǎng)，在第14天進行茜素紅染色，呈現(xiàn)大小形態(tài)不一的桔紅色陽性結(jié)節(jié) （圖2），每孔隨機選擇6個視野，低倍鏡下對6個視野的礦化結(jié)節(jié)計數(shù)，表3所示為補骨脂不同炮制品含藥血清處理組成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)數(shù)量。

表2 補骨脂不同炮制品含藥血清對人成骨細(xì)胞分化活性的影響 (x±s,n=4)Tab.2 Effects of the serum containing processed Buguzhi on human osteoblasts differentiation(x±s,n=4)

圖2 人成骨細(xì)胞鈣茜素紅染色圖 (x 10)Fig.2 Representative photograph of m ineralization nodu les staining in human osteoblast treated w ith serum containing processed Buguzhi(x 10)

表3 補骨脂不同炮制品含藥血清對人成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)數(shù)量的影響 (x±s,n=6)Tab.3 Effects of the serum containing p rocessed Buguzhi on human osteoblasts m ineralization nodu les(x± s,n=6)

結(jié)果表明，與空白對照組相比，空白血清對成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的形成無顯著的作用，而補骨脂生品及鹽炙品含藥血清具有促進成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成的作用，且補骨脂鹽炙品的作用要優(yōu)于生品。

4 討論

成骨細(xì)胞來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，由成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成，主要由兩個重要的環(huán)節(jié)組成。首先，成骨細(xì)胞分化的骨標(biāo)記基因的表達(dá) （I型膠原蛋白、骨調(diào)素、骨唾液酸蛋白、骨鈣素），第二就是細(xì)胞基質(zhì)中由Ca、P沉積所形成的細(xì)胞外基質(zhì)礦化［9］。成骨細(xì)胞在骨形成過程中要經(jīng)歷細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)成熟、礦化和細(xì)胞凋亡4個階段，這4個階段均需借助精細(xì)的調(diào)控，以最終完成正常的骨形成［10］。當(dāng)成骨細(xì)胞數(shù)量不足或活性較低時，就不能維持骨的完整性和功能發(fā)揮所必需的骨形成和骨吸收之間的動態(tài)平衡，從而使得骨形成大于骨吸收，久之便造成骨質(zhì)疏松［11-13］。在正常骨重建的過程中，無論是增加成骨細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化都可增強骨形成。成骨細(xì)胞的功能是維持骨形成和正常骨質(zhì)密度的關(guān)鍵因素。因此，刺激成骨細(xì)胞的增殖，分化和礦化能促進骨形成，從而防止骨量丟失，降低骨折發(fā)生率。因此，防治骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵之一是提高成骨細(xì)胞增殖、分化的能力［14-15］，而促進成骨細(xì)胞功能的中藥是預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的藥物之一。

本研究采用絕經(jīng)后婦女分離得到的成骨細(xì)胞，利用補骨脂生品和鹽炙品含藥血清干預(yù)成骨細(xì)胞，干預(yù)48 h后，成骨細(xì)胞增殖率顯著增加，且血清體積分?jǐn)?shù)為20%時，鹽炙品顯著優(yōu)于生品，說明補骨脂能夠促進成骨細(xì)胞的增殖。堿性磷酸酶［10］是成骨細(xì)胞分化早期的標(biāo)志，在本研究中含藥血清干預(yù)細(xì)胞72 h后，成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性顯著提高，且血清體積分?jǐn)?shù)為20%時，鹽炙品顯著優(yōu)于生品。說明補骨脂能夠促進成骨細(xì)胞的分化。礦化是成骨細(xì)胞在骨形成時期所必須經(jīng)歷的階段，本研究中不同炮制品含藥血清干預(yù)成骨細(xì)胞14 d后，所形成的礦化結(jié)節(jié)顯著增加，且鹽炙品要優(yōu)于生品。

本實驗研究鹽炙對補骨脂體外藥效的影響，采用體外成骨細(xì)胞模型，采用MTT法，ALP活性測定法，茜素紅染色法，研究補骨脂含藥血清對于成骨細(xì)胞活性的影響，結(jié)果顯示補骨脂的含藥血清具有成骨細(xì)胞活性，能夠促進成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化，鹽炙增強了補骨脂含藥血清促進成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化的活性。說明了補骨脂鹽炙入藥的合理性和必要性，為中藥炮制機理研究奠定基礎(chǔ)，為中醫(yī)臨床用藥提供新的研究思路。

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Effect of serum containing raw and salt-processed Buguzhion human osteoblasts

GAO Qian-qian1，2， YAN Cui-ping3， WENG Ze-bin1，2， ZHAO Gen-hua1，2， CHEN Zhi-peng1，2，CAIBao-chang1，2， LIWei-dong1，2*
（1.Nanjing University of Chinese Medicine，Jiangsu Key Laboratory of Chinese Medicine Processing，F(xiàn)ngineering Center of State Ministry of Fducation for Standardization of Chinese Medicine Processing，Nanjing 210046，China；2.Pharmacy College of Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210046，China；3.Jiangsu Jumpcan Pharmaceutical Group Co.，Ltd，Taizhou 225400，China）

AIMTo investigate the effectof serum containing raw and salt-processed Buguzhi（Psoralea corylifolia L.）on the proliferation，differentiation，and mineralization of human osteoblasts.METHODSOsteogenic cells were obtained from the femur in postmenopausalwomen.Serum containing raw or salt-processed Buguzhiwas incubated with human osteoblasts.Their effectswere determined by MTTmethod，including the activity of alkaline phosphatase and alizarin red staining by using commercial ELISA kits.RESULTSSerum containing raw or saltprocessed Buguzhi promoted human osteoblast proliferation and ALP activity compared with the control.When the concentration of serum reached 20%，the effects of salt-processed Buguzhion the proliferation，differentiation of osteoblast significantly exceeded thatof raw Buguzhi（P＜0.01）.CONCLUSIONSerum containing raw and saltprocessed Buguzhi can increase proliferation，differentiation，and mineralization activities in human osteoblast and the salt-processed Buguzhi is significantly better than the raw one.

Buguzhi（Psoralea corylifolia L.）；salt processing；osteoblast；osteoporosis

R283；R285.5

：A

：1001-1528（2015）07-1402-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.003

2014-11-15

江蘇省高校自然科學(xué)基金重點項目 （11KJA360001）；江蘇省中藥學(xué)優(yōu)勢學(xué)科開放課題 （2001ZYX2-010）

高倩倩 （1990—），女，碩士生，主要從事中藥炮制機理研究。Tel：18351895575，E-mail：18351895575@163.com

*通信作者：李偉東 （1969—），男，博士，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥炮制機理研究。Tel：（025）86798281，E-mail：liweidong0801@163.com