■李 豐 葉竹林 鄭衛(wèi)紅 賴(lài)彩冰 彭志通

（廣州匯標(biāo)檢測(cè)技術(shù)中心，廣東廣州 510300）

魚(yú)粉是一種必需氨基酸種類(lèi)相當(dāng)平衡的優(yōu)質(zhì)動(dòng)物性蛋白質(zhì)原料，可通過(guò)氨基酸分析對(duì)魚(yú)粉的質(zhì)量予以評(píng)價(jià)[1-2]。魚(yú)粉氨基酸分析首先要用不同的水解方式將肽鏈打開(kāi)。目前最常用的水解方式是GB/T 18246—2000中的常規(guī)水解法和微波水解法。常規(guī)水解法是使蛋白質(zhì)在鹽酸的作用下，經(jīng)液氮或干冰冷凍，抽真空后封口，再放入恒溫干燥箱中，水解22～24 h后形成單一氨基酸[3]。此過(guò)程步驟繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，勞動(dòng)強(qiáng)度大且處理過(guò)程中部分氨基酸易損失。微波水解是使用微波爐在2 450 Hz的微波電磁場(chǎng)的作用下，微波通過(guò)試樣及鹽酸時(shí)，極性分子隨微波頻率快速變換取向，分子來(lái)回轉(zhuǎn)動(dòng)，與周?chē)肿酉嗷ヅ鲎?，分子的總能量增加，使試樣溫度急劇上升。這種加熱方式與傳統(tǒng)的加熱方式相比具有操作簡(jiǎn)單、樣品水解快、節(jié)約能源、工作效率高和勞動(dòng)強(qiáng)度小等優(yōu)點(diǎn)[4-5]。因此，研究微波水解法快速測(cè)定魚(yú)粉氨基酸的含量，有助于提高檢測(cè)效率。有筆者也對(duì)微波水解法測(cè)定魚(yú)粉中氨基酸進(jìn)行了研究[4]，從微波水解法的快速、準(zhǔn)確方面入手，得出研究數(shù)據(jù)。但是并沒(méi)有考察微波水解法最佳條件及檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性。本研究根據(jù)蛋氨酸和賴(lài)氨酸含量的高低可以判斷魚(yú)粉質(zhì)量的優(yōu)劣[6]，從魚(yú)粉蛋氨酸和賴(lài)氨酸含量測(cè)定方面入手，考察微波水解法最佳條件及檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性。本研究擬通過(guò)正交設(shè)計(jì)選擇微波水解的最佳條件并在一定時(shí)期內(nèi)探討微波水解的穩(wěn)定性，同時(shí)與常規(guī)水解方法相比較，以探索微波水解快速測(cè)定氨基酸的可行性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

魚(yú)粉樣品為市售進(jìn)口魚(yú)粉；16種氨基酸混標(biāo)（Sigma）；巰基乙醇（Sigma）、茚三酮（Sigma）、乙腈（Merck）、甲醇（Merck）、純凈水（實(shí)驗(yàn)室自制）,其他試劑均為分析純。

氨基酸分析儀（日立L-8900）、EZChromtion工作站、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9030A，上海一恒）、電子天平（EL104，梅特勒）、氮吹儀（N-Evap，Organomation）、微波消解儀（mutiwave GO，安東帕）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 微波水解正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用L9(34)四因素三水平正交試驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表1。

表1 微波水解魚(yú)粉的因素水平設(shè)計(jì)

1.2.2 微波水解穩(wěn)定性試驗(yàn)設(shè)計(jì)

魚(yú)粉的微波水解氨基酸穩(wěn)定性考察時(shí)間為3個(gè)月。樣品保存于0～4℃冰箱冷藏柜中備用。按所選擇的最佳微波水解條件，分別于2015年3月5日、3月18日、4月9日、4月21日、5月11日、5月29日對(duì)魚(yú)粉的氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 試驗(yàn)操作

1.2.3.1 微波水解魚(yú)粉

稱(chēng)取約20 mg魚(yú)粉，放入水解罐中，加入6 mol/l鹽酸溶液0.5 ml，抽真空，再充入高純氮以排凈空氣。密封放入微波爐中，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)擬定微波水解條件設(shè)置微波爐，開(kāi)始水解。水解結(jié)束后冷卻至常溫，開(kāi)罐，過(guò)濾入25 ml容量瓶，用去離子水定容。搖勻后移取一定量溶解液至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，旋轉(zhuǎn)蒸干，以0.02 mol/l HCl溶解蒸發(fā)的剩余物，定容至100 ml容量瓶中，搖勻，以注射器吸取后通過(guò)濾膜，抽濾入專(zhuān)用進(jìn)樣瓶。最后上機(jī)分離、測(cè)定。所有樣品重復(fù)4次測(cè)定，結(jié)果取平均值。

1.2.3.2 常規(guī)水解魚(yú)粉

樣品前處理參考GB/T 18246—2000中酸水解法，其余步驟同微波水解。所有樣品重復(fù)4次測(cè)定，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果分析（見(jiàn)表2～表4）

表2 微波水解魚(yú)粉中蛋氨酸結(jié)果

表3 微波水解魚(yú)粉中賴(lài)氨酸結(jié)果

表4 常規(guī)水解魚(yú)粉結(jié)果

綜合表2～表4的試驗(yàn)結(jié)果可知，微波水解法3個(gè)因素的主次順序?yàn)椋築→C→A，與常規(guī)水解結(jié)果相比可得微波水解最佳組合為：A1B2C2，即在巰基乙醇含量0.5%，160℃下水解20 min。

正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果：賴(lài)氨酸FB=5.789＞F0.05(2，6)、FA=0.196 4＜F0.10(2，6)、FC=0.42＜F0.10(2，6)；蛋氨酸FA=0.733＜F0.10(2，6)、FB=0.318＜F0.10(2，6)、FC=0.236＜F0.10(2，6)。方差分析表明：B因素對(duì)魚(yú)粉的賴(lài)氨酸有顯著性影響，A和C因素對(duì)魚(yú)粉賴(lài)氨酸無(wú)顯著性影響；A、B、C 3個(gè)因素對(duì)魚(yú)粉的蛋氨酸均沒(méi)有顯著性影響。

2.2 微波水解穩(wěn)定性分析

6次微波水解穩(wěn)定性結(jié)果見(jiàn)表5。從表5可知，魚(yú)粉在為期3個(gè)月的試驗(yàn)過(guò)程中，參與比較分析的2種氨基酸結(jié)果的RSD值均小于1.0%。經(jīng)F檢驗(yàn)，同一魚(yú)粉樣品在不同時(shí)間的賴(lài)氨酸和蛋氨酸含量測(cè)定結(jié)果均不存在顯著差異(F＜F0.10)。

表5 魚(yú)粉微波水解穩(wěn)定性結(jié)果（%）

2.3 常規(guī)水解法和微波水解法測(cè)定結(jié)果比較

①微波輔助水解法與常規(guī)水解法進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表6。兩種水解方法測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差均小于2.0%，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18246—2000《飼料中氨基酸的測(cè)定》規(guī)定要求，經(jīng)F檢驗(yàn)，微波輔助水解法與常規(guī)水解法測(cè)定結(jié)果不存在顯著差異(F＜F0.10)，在所選擇的最佳條件下微波水解法測(cè)定結(jié)果與常規(guī)水解法一致。

表6 微波水解與常規(guī)水解結(jié)果對(duì)比(%)

②在微波水解過(guò)程中，由于高壓和高溫，具有極性側(cè)鏈的氨基酸，如蘇氨酸、絲氨酸等易被破壞，回收率比較低，所以在考慮用微波水解法測(cè)定氨基酸含量的同時(shí)要考慮到個(gè)別氨基酸的含量測(cè)定偏低問(wèn)題。

3 結(jié)論

①?gòu)囊陨辖Y(jié)果分析可知，微波水解的最佳條件是巰基乙醇含量0.5%、溫度160℃、水解時(shí)間20 min；通過(guò)比較分析3個(gè)月內(nèi)魚(yú)粉氨基酸結(jié)果的變化情況，證明微波水解法的穩(wěn)定性較好。

②微波水解法與常規(guī)水解法在測(cè)定時(shí)間上差別較大，常規(guī)水解法至少水解22 h，而微波水解最多只需20 min，因?yàn)槲⒉ㄋ獾募訜岱绞脚c常規(guī)水解的加熱方式截然不同，除了分子間的來(lái)回運(yùn)動(dòng)升溫，試液中的帶電粒子在交變的電磁場(chǎng)中受電場(chǎng)力的作用而來(lái)回遷移運(yùn)動(dòng)，也會(huì)與臨近分子撞擊，使試樣溫度升高，從而加快了水解速度，使工作效率提高了20倍以上。

③微波水解法與常規(guī)水解法在所用實(shí)驗(yàn)儀器上，常規(guī)水解需要儀器設(shè)備較多，操作繁瑣且勞動(dòng)強(qiáng)度大。而微波水解只需微波消解爐，操作簡(jiǎn)單。

綜上所述，微波水解法具有操作簡(jiǎn)捷、方便、快速，不但節(jié)約了試劑，更節(jié)約了能源，大大提高了工作效率而且測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。因此，可應(yīng)用于魚(yú)粉國(guó)標(biāo)中氨基酸的快速測(cè)定。