■彭思源 王學(xué)東 李 彪 胡先勤龔阿瓊 鄭紅生 何林玲

（1.武漢輕工大學(xué)，湖北武漢 430023；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443003；3.武漢永生鴨業(yè)有限公司，湖北武漢 430077）

從微生物防控角度預(yù)防疾病，利用有益菌治療致病菌的原理控制預(yù)防疾病的發(fā)生，從而減少養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的用藥是其中最關(guān)鍵一環(huán)。熱休克蛋白（Hot shock protein，Hsp）通常被稱為應(yīng)激蛋白或蛋白分子伴侶[1]。它是一切有生命細(xì)胞遇短暫高溫、缺氧、亞砷酸鹽及H2O2等應(yīng)激原刺激時所發(fā)生的一種以基因表達(dá)和調(diào)控變化為特征的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)[2]。根據(jù)Hsp的相對分子質(zhì)量，主要的Hsp被分成6個家族：大分子量Hsp家族、Hsp90家族、Hsp70家族、Hsp60家族、小分子量Hsp家族和泛素[3-4]。其中熱激蛋白的累積與細(xì)胞耐熱性的提高具有密切相關(guān)性，如Lindquist等[5]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)的Hsp104對酵母的耐熱性大大提高具有積極作用。Hsp70的細(xì)胞保護(hù)作用是指機(jī)體細(xì)胞在收到各種應(yīng)激、如高溫，氧化等有害應(yīng)激時，產(chǎn)生的Hsp70可以增強(qiáng)細(xì)胞對損害的耐受程度，維持細(xì)胞的正常功能代謝，提高細(xì)胞生存率[6]。幾乎所有的細(xì)胞均能合成熱休克蛋白，其中Hsp70家族含量最多亦最重要。目前認(rèn)為Hsp70具有多種功能，是一種非特異性細(xì)胞保護(hù)蛋白，因此備受關(guān)注[2]。本試驗旨在從肉鴨消化道內(nèi)分離篩選出5株釀酒酵母中，通過熱激處理選取最有高抗性的菌株，并探究溫度與酵母菌株胞內(nèi)熱休克蛋白的相關(guān)性，本研究為開發(fā)高抗性、專一型的酵母益生菌制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

本實驗室從肉鴨腸道分離保存的5株釀酒酵母。

1.1.2 培養(yǎng)基

瓊脂培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基均為國產(chǎn)。

1.1.3 試劑

0.5 mol/l Tris-HCl pH值6.8、10%SDS(BIOSHARP)、0.1%溴酚藍(lán)（BIOSHARP）、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（BEYOTIME）、marker(THERMO)、0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250（BIOSHARP）;β-巰基乙醇、甘油等均為國產(chǎn)。

1.1.4 儀器設(shè)備（公司名稱）

單人單面凈化工作臺（SW-CJ-1FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司）、恒溫恒濕培養(yǎng)箱（LRHS-150-Ⅱ，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）、恒溫培養(yǎng)振蕩器（HNY-200B，天津市歐諾儀器儀表有限公司）、手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器（YX280A，上海三申醫(yī)療器械有限公司）、高壓均質(zhì)機(jī)（AH-2010，ATS Engineering Limited）、電泳儀（PowerPac，BIO-RAD）、凝膠成像儀（Gel DocTMEZ，BIO-RAD）、離心機(jī)（TDZ5-WS，平凡儀器）、超聲波儀（UWave-1000，新儀）、超純水系統(tǒng)（Milli-Q Intergral，美國Millipore密理博）、醫(yī)用低溫保存箱（DW-40L188，青島海爾特種電器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母菌的培養(yǎng)

將5株釀酒酵母分別接種于YPD培養(yǎng)基中，28℃、160 r/min 2次培養(yǎng)（以獲得第二代酵母細(xì)胞）至對數(shù)期（107～108個/ml）[7]。

1.2.2 酵母菌超聲波法破壁[8]

稱取適量酵母泥，加入0.5 mol/l Tris-HCl pH值6.8，按料液比1∶3，制成酵母懸液，設(shè)定功率300 W，于冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎30 min（設(shè)定工作5 s，間隔10 s）。

1.2.3 酵母菌凍融法破壁[8]

稱取適量酵母泥，加入0.5 mol/l Tris-HCl pH值6.8，按料液比1∶3制成酵母懸液，分別于-20℃冰箱中反復(fù)凍融3～5次，每次冷凍時間2 h，100℃水浴中解凍20 min。

1.2.4 酵母菌高壓均質(zhì)機(jī)破壁

稱取適量酵母泥，加入0.5 mol/l Tris-HCl pH值6.8，按料液比1∶3制成酵母懸液[9]，均質(zhì)壓力調(diào)整為140 MPa，經(jīng)2～3次循環(huán)。

1.2.5 酵母菌染色

用呂氏堿性美蘭進(jìn)行染色，破壁的酵母呈蘭紫色，而未破壁的酵母呈無色透明，分別計數(shù)，并采用相同的稀釋度用血球記數(shù)板進(jìn)行鏡檢記數(shù)。計算破壁率。破壁率的計算公式：

式中：α——破壁率（%）；

c——破壁前的細(xì)胞數(shù)（相同稀釋倍數(shù)）；

c'——破壁后的細(xì)胞數(shù)（相同稀釋倍數(shù)）；

n1——染色后呈無色透明細(xì)胞數(shù)；

n2——染色后呈蘭紫色細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 酵母熱休克處理及電泳樣品制備

根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報道基礎(chǔ)上做了適當(dāng)?shù)姆治鯷10]，選擇30、37、42、45、48℃和50℃溫度梯度對釀酒酵母菌進(jìn)行熱激誘導(dǎo)處理30 min。4 000 r/min離心5 min收集菌體，用超純水洗滌三次。按料液比1∶3加入0.5 mol/l Tris-HCl pH值6.8，調(diào)節(jié)高壓均質(zhì)機(jī)140 MPa作用3次。加入數(shù)滴巰基乙醇、甘油、10%SDS、溴酚藍(lán)。

1.2.7 凝膠電泳的制備

測定蛋白質(zhì)分子量需進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)文獻(xiàn)[11]進(jìn)行料液配比。分離膠濃度為8%，濃縮膠濃度為5%，染色液為0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250溶液，脫色液為10%無水乙醇和10%乙酸溶液。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同破壁方法的破壁率（見表1）

表1 凍融法、超聲波法、高壓均質(zhì)機(jī)破壁率(%)

釀酒酵母在凍融法、超聲波法和高壓均質(zhì)法等三種方法處理后，測定其破壁率，發(fā)現(xiàn)運(yùn)用高壓均質(zhì)法破壁效果最好。當(dāng)進(jìn)行3次均質(zhì)、原菌液稀釋102時，菌株的破壁率達(dá)到94.54%。同時高壓均質(zhì)機(jī)在物理方法處理細(xì)胞壁中能有效地控制溫度對細(xì)胞和熱休克蛋白的活性。本試驗方法簡單，便于后續(xù)試驗的操作。

2.2 菌株熱擊處理后的蛋白變化

5株釀酒酵母在不同溫度下用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒提取熱處理破壁后釀酒酵母菌中分泌的熱休克蛋白(結(jié)果見圖1～圖5)。

圖1 1號菌株不同溫度進(jìn)行熱激處理

圖2 2號菌株不同溫度進(jìn)行熱激處理

圖3 3號菌株不同溫度進(jìn)行熱激處理

圖4 4號菌株不同溫度進(jìn)行熱激處理

圖5 5號菌株不同溫度進(jìn)行熱激處理

從圖中可以看出，5株釀酒酵母在熱激處理后新出現(xiàn)了2種清晰的蛋白條帶，或部分原有蛋白表達(dá)量增加了，分子量分別位于70 kD和90 kD附近，推測其可能為熱休克70家族和熱休克90家族；另一方面，熱休克應(yīng)答后，許多蛋白條帶顏色變淺，表面在熱休克過程中，酵母減少了一些正常蛋白的合成。

2.3 熱休克應(yīng)答內(nèi)參法蛋白圖譜比較

5株釀酒酵母分別提取胞內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行SDSPAGE電泳（見圖1～5），在此基礎(chǔ)上使用IMAGE LAB調(diào)整體積進(jìn)行分析獲得折線圖（見圖6～10）。

3 討論

3.1 不同破壁效果的差異

對酵母進(jìn)行高效的破壁處理，是保障后期蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳質(zhì)量的前提條件。不同破壁方法有各自的優(yōu)缺點(diǎn)（如表2）。

圖6 1號菌株不同溫度內(nèi)參法比較

圖7 2號菌株不同溫度進(jìn)行熱激處理

圖8 3號菌株不同溫度進(jìn)行熱激處理

圖9 4號菌株不同溫度進(jìn)行熱激處理

圖10 5號菌株不同溫度進(jìn)行熱激處理

本研究高壓均質(zhì)處理，酵母的破壁率明顯高于凍融法和超聲波法。究其原因，這是由于高壓均質(zhì)可破壞酵母細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，消除底物和酵母內(nèi)源酶的空間位阻，從而加速酵母細(xì)胞的自溶，有利于蛋白質(zhì)RNA等大分子物質(zhì)的降解[9]。在一定范圍內(nèi)，均值壓力越高對酵母破壁越有利，但綜合設(shè)備均值壓力的限制和操作能耗等因素，均質(zhì)壓力并不是越高越好，應(yīng)當(dāng)有一個最佳值[12]。本試驗中，在140 MPa壓力下，經(jīng)2～3次循環(huán)，即可獲得良好的破壁率。

3.2 熱應(yīng)激蛋白與溫度的相關(guān)性

有研究表明，機(jī)體在高溫等不良環(huán)境中會自發(fā)產(chǎn)生熱休克應(yīng)答反應(yīng)來保護(hù)自己[13]。酵母在熱休克應(yīng)答過程中，能極快地誘導(dǎo)產(chǎn)生一組特殊的蛋白質(zhì)——熱休克蛋白（HSP）[14]，細(xì)胞耐熱性的增強(qiáng)同熱激蛋白的累積密切相關(guān)[15]。從圖1～圖5可以看出在30℃下目標(biāo)蛋白不夠清晰，37℃之后逐漸清晰，42℃后條帶表達(dá)量對比值達(dá)到最大分泌，到達(dá)最高值。之后雖然還存在目標(biāo)蛋白但表達(dá)量不夠,逐漸減少。根據(jù)圖6～圖10知道第3株菌株的耐熱性相對于其他菌株而言更好，它在45、48℃的表現(xiàn)比其他4株更為明顯。

表2 凍融法、超聲波法、高壓均質(zhì)法原理及優(yōu)缺點(diǎn)

酵母菌具有十分復(fù)雜的耐熱機(jī)制，該機(jī)制與細(xì)胞內(nèi)多個生理過程的改變有著密切關(guān)聯(lián)，維持細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的過程，包括誘導(dǎo)表達(dá)熱激蛋白的過程[16]，重構(gòu)代謝過程等[17-18]。本試驗釀酒酵母熱擊后新出現(xiàn)了2種清晰的蛋白條帶，經(jīng)目前HSP的分類系統(tǒng)[19]比較后應(yīng)屬于熱休克蛋白70家族和熱休克蛋白90家族。但并不是所有菌株都明顯出現(xiàn)熱休克90家族。

對于未來研發(fā)高抗性酵母益生菌制劑及代替抗生素，成為一種安全的生物制劑。對于動物消化道菌落具有調(diào)節(jié)作用，后期也可加入飼料中，增強(qiáng)其耐受性。

4 結(jié)論

肉鴨消化道酵母菌株的耐熱性存在差異，不同菌株的耐熱性與熱休克蛋白70家族和90家族的表達(dá)密切相關(guān)。研究試驗菌株中3號菌株的熱應(yīng)激耐受性最佳，可以作為后續(xù)肉鴨專用飼用酵母益生菌的備選菌株，為開發(fā)高抗性、專一型的酵母益生菌制劑奠定基礎(chǔ)。