■史艷艷 劉慶生 范志影 李 俊 秦玉昌

（1.天津市獸藥飼料監(jiān)察所，天津 300402；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081；3.農(nóng)業(yè)部食物與營養(yǎng)發(fā)展研究所，北京 100081）

飼料中添加激素類物質(zhì)可以促進(jìn)家畜的生產(chǎn)力，降低動物死亡率，縮短動物飼養(yǎng)周期，促進(jìn)動物性產(chǎn)品產(chǎn)量的增長，具有穩(wěn)定的增產(chǎn)效果。這些雌性激素在人體內(nèi)富集會造成人體內(nèi)分泌紊亂，兒童受到的危害尤其大。常見的雌性激素有雌二醇、雌三醇、雌酮、炔雌酮、苯甲酸雌二醇、己烯雌酚、己二烯雌酚和染料木素等多種，其中染料木素屬植物雌激素。建立上述8種雌激素簡便高效的分析方法是非常必要而且有意義的工作。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚等的雌激素分析方法主要分為HPLC法[1]、GC-MS法[2]、熒光法[3]、LC-MS/MS法[4-6]、酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）[7-8]等。其中HPLC法的靈敏度較低、排除干擾能力差，難以滿足低殘留限量的檢測要求；GC-MS法需要衍生，前處理過程繁瑣，并且衍生效率對結(jié)果的準(zhǔn)確度影響大；酶聯(lián)免疫分析法靈敏度高，但難以對多組分化合物進(jìn)行同時測定；LC-MS/MS抗背景干擾能力強(qiáng)，分辨率較高、靈敏度高、選擇性好，常用于痕量檢測，并且同時具備定性定量能力。常見的激素或抗生素多以液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析，采用除色譜保留時間外，兩次選擇（MRM模式）有效排除色譜同流出物質(zhì)，并且同一方法中可同時實(shí)現(xiàn)多種（＞100種）化合物的分析。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是目前有毒有害物質(zhì)，包括雌性激素在內(nèi)的化合物的常見分析方法。但針對雌二醇、雌三醇、雌酮、炔雌酮、苯甲酸雌二醇、己烯雌酚、己二烯雌酚和染料木素等8種化合物同時檢測的LC-MS/MS定性法尚未見報(bào)道。本文著力于建立一種樣品前處理簡單、靈敏度高、適用范圍廣且能夠同時檢測上述8種雌激素類的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和設(shè)備

Nexera UHPLC LC-30A超高效液相色譜儀(日本島津公司)、API 3200質(zhì)譜儀（AB SCIEX公司）、超聲波水?。▽幉êＪ锍晝x器公司）、AB204-E型電子分析天平（METTLER公司）、RH2000離心機(jī)（湖北湘宜有限公司）、渦旋振蕩器（美國IKA公司）、純水儀（美國密立博公司）。

1.2 試劑與藥品

甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、甲酸銨（色譜純）、氯化鈉（分析純）、亞鐵氰化鉀（分析純）、乙酸鋅（分析純）、正己烷（分析純）、乙酸（分析純）、雌二醇、雌三醇、雌酮、炔雌酮、苯甲酸雌二醇、己烯雌酚、己二烯雌酚：純度＞98%，均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。染料木素：純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司，批號：KA0412CB13。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)品用少量乙腈溶解，色譜純乙腈定容配制1 mg/ml標(biāo)準(zhǔn)儲備液，混合均勻后密封冷凍保存。根據(jù)需要將標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋至1 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃下保存，使用前純水稀釋一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 儀器參數(shù)

1.4.1 質(zhì)譜條件

利用電噴霧離子源（ESI），采用MRM多反應(yīng)監(jiān)測。負(fù)離子模式下（ESI-）：噴霧電壓（IS）-3 500 V，霧化氣（GS1）40 ml/min，氣簾氣（CUR）30 ml/min，輔助加熱氣（GS2）65 L/min，離子源溫度（TEM）550℃，碰撞氣6 ml/min，4種氣體均為氮?dú)?；Q1和Q3均為單位分辨率；正離子模式下(ESI+)：噴霧電壓(IS)+5 000 V，霧化氣（GS1）55 ml/min，氣簾氣（CUR）20 ml/min，輔助加熱氣（GS2）65 L/min，離子源溫度（TEM）550℃，碰撞氣6 ml/min，4種氣體均為氮?dú)?；Q1和Q3均為單位分辨率。8種雌激素的質(zhì)譜優(yōu)化條件見表1。

表1 MRM監(jiān)測模式下8種雌激素的質(zhì)譜優(yōu)化條件

1.4.2 色譜條件

色譜柱：Kinetex2.6 C18柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；進(jìn)樣量：20 μl；流動相A為乙腈，流動相B為5 mM乙酸銨溶液，進(jìn)行梯度洗脫。梯度洗脫：0～2 min，維持20%A；2～4 min，20%A線性變化至60%A；4～5 min，60%A線性變化至70%A；5～6 min，70%A線性變化至95%A；6～6.1 min，維持95%A；6.1～8 min，維持20%A。

1.5 樣品處理

稱取1.0 g（精確至0.001 g）飼料樣品，置于50 ml具塞塑料離心管中，加入2 ml蒸餾水，待飼料浸潤后再加入18 ml甲醇，渦旋混勻1 min，振蕩10 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液，加入20 ml正己烷，渦旋，振蕩10 min，10 000 r/min離心5 min，取下層液體，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑，蒸干后用20%乙腈水溶液2 ml溶劑，過0.2 μm濾膜，上機(jī)分析[9-10]。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化選擇

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

為獲得最佳的電離方式，采用流動注射泵連續(xù)進(jìn)樣方式進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化，分別將上述8種雌激素于正、負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描，以選擇適當(dāng)?shù)碾婋x方式和分子離子峰。結(jié)果表明雌二醇、雌三醇、雌酮、炔雌酮、己烯雌酚和己二烯雌酚在負(fù)離子[M-H]-模式下響應(yīng)值高，苯甲酸雌二醇和染料木素在正離子[M+H]+模式下響應(yīng)強(qiáng)度最高。根據(jù)歐盟2002/657/EC指令[11]規(guī)定，于質(zhì)譜驗(yàn)證方法必須達(dá)到4個驗(yàn)證點(diǎn)的要求，在確定母離子的基礎(chǔ)上選擇兩個或兩個以上子離子。在確定上述8種雌激素的母離子后，采用子離子掃描對子離子進(jìn)行優(yōu)化選擇，通過優(yōu)化離子源參數(shù)以及去簇電壓、出口電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)，使每種雌激素的離子化效果達(dá)到最佳。

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

2.1.2.1 色譜柱的選擇

選擇實(shí)驗(yàn)室已有Kinetex2.6 C18柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）、Dionex Aalaim120 C18（3 mm×150 mm，3 μm）、Agilent XDB-C18（3 mm×100 mm，3.5 μm）、Phoenix Luna C18（2.0 mm×150 mm，3 μm）4種色譜柱，按照相同梯度、相同濃度采集樣品，得到不同的分離度及信號響應(yīng)。

通過對比，4種色譜柱中Kinetex C18信號響應(yīng)最高（見圖1），峰型尖銳，峰型較對稱，且出峰速度快，節(jié)省溶劑。因此本研究采用Kinetex C18作為分離柱。

圖1 Kinetex C18柱負(fù)離子模式下6種化合物信號響應(yīng)

2.1.2.2 流動相的選擇

將8種雌激素在同一方法中進(jìn)行分析，不在有機(jī)相中添加甲酸、乙酸等酸性或氨水等增強(qiáng)電離的化合物，只能選擇甲醇、乙腈等常規(guī)溶劑配合甲酸銨或乙酸銨使用。一般地，乙腈和甲醇均可作為洗脫液，本研究根據(jù)實(shí)驗(yàn)習(xí)慣，選擇乙腈作為洗脫液。在相同含量下，5 mM甲酸銨和5 mM乙酸銨進(jìn)行對比，使用5 mM乙酸銨時信號略強(qiáng)，整體無太大差距，本研究根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測習(xí)慣，使用乙酸銨增強(qiáng)電離能力。

通過選擇不同的液相梯度，得到不同的保留時間和信號強(qiáng)度，分別按照不同初始有機(jī)相比例和有機(jī)相變化速度設(shè)定不同的方法，詳細(xì)數(shù)據(jù)見表2。

表2 不同初始有機(jī)相比例流動相列表

隨著初始有機(jī)相比例的降低，色譜峰分離效果越好，保留時間略微偏后，靈敏度增加較為明顯。初始的有機(jī)相比例低，色譜柱保留效果好，對應(yīng)的分離度增加。圖2中可見，設(shè)置條件c時，色譜峰峰型尖銳，分離度好且響應(yīng)值最高，此時流動相比例最為合理。由表2可知，采用初始有機(jī)相比例20%，保持2.0 min，隨后增加有機(jī)相比例，在4.0 min時達(dá)到60%；繼續(xù)增加有機(jī)相比例，在5.0 min時達(dá)到70%；繼續(xù)增加到5.1 min時設(shè)置95%；穩(wěn)定1 min；6.1 min降為20%，維持2.0 min結(jié)束。因此，選擇乙腈和5 mM乙酸銨作為流動相進(jìn)行梯度洗脫。

圖2 c流動相條件下的色譜圖

2.2 樣品前處理的選擇

儀器方法優(yōu)化成功后，篩選前處理方法。文中采用典型的幾種提取、凈化方法用于處理飼料及其相關(guān)產(chǎn)品，利用空白基質(zhì)加標(biāo)分別添加相當(dāng)于10 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液到飼料和生鮮乳中，以期得到一種簡單快速、環(huán)境友好的實(shí)驗(yàn)方法。

2.2.1 乙腈提取法

稱取1.0 g（精確至0.001 g）樣品，置于50 ml具塞塑料離心管中，添加10 ml乙腈，渦旋混合均勻后超聲波提取15 min，離心機(jī)高速離心，過0.2 μm濾膜，上機(jī)分析。

2.2.2 液液萃取法

稱取1.0 g（精確至0.001 g）飼料樣品，置于50 ml具塞塑料離心管中，加入2 ml蒸餾水，待飼料浸潤后再加入18 ml甲醇，渦旋混勻1 min，振蕩10 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液，加入20 ml正己烷，渦旋，振蕩10 min，10 000 r/min離心5 min，取下層液體，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑，蒸干后用20%乙腈水溶液2 ml溶劑，過0.2 μm濾膜，上機(jī)分析。

2.2.3 固相萃取法

稱取1.0 g（精確至0.001 g）樣品，置于50 ml具塞塑料離心管中，加入pH值為5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液10 ml、酶解液50 μl，于37℃水浴振蕩器中酶解12 h后取出，冷卻至室溫，加入20 ml甲醇超聲提取15 min，10 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入100 ml雞心瓶中，殘?jiān)僖?5 ml甲醇提取1次，10 000 r/min離心10 min，合并2次的上清液。向上清液中加入10 ml正丙醇，于45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至殘液基本為水時(約10 ml)，加入1 ml甲醇超聲混勻后上LC-C18固相萃取柱，并以適量體積分?jǐn)?shù)的10%甲醇水溶液洗滌雞心瓶，洗滌液一并上LC-C18固相萃取柱。以5 ml 10%的甲醇溶液淋洗后抽至近干，下端接已用5 ml甲醇活化的LC-NH2柱，以8 ml 90%的甲醇洗脫。洗脫液于50℃下N2吹干，加入1 ml 80%的甲醇溶液，旋渦混勻1 min，超聲2 min溶解，過0.2 μm濾膜，上機(jī)分析。

對比上述三種前處理方法，得到的結(jié)果見表3。從結(jié)果中看出，回收率最好的為液液萃取法，其次為乙腈提取法，而固相萃取法回收率最差。實(shí)際固相萃取法回收率雖然不高，但是凈化效果好，得到的上機(jī)液較為純凈，分析結(jié)果受基質(zhì)影響小。由于固相萃取法操作復(fù)雜，容易在分析過程中，因?yàn)椴襟E繁瑣導(dǎo)致人為錯誤進(jìn)而影響分析結(jié)果。所以在實(shí)驗(yàn)中，優(yōu)先采用液液萃取法前處理方法。

表3 前處理回收率（%）

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及重現(xiàn)性

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

逐步稀釋8種雌激素標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到一系列濃度，逐個采集數(shù)據(jù)，每個濃度重復(fù)3次。分別稀釋到0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng等12個梯度，采集數(shù)據(jù)后，按照1/X2權(quán)重計(jì)算，濃度與峰面積歸一計(jì)算法，采集MRM數(shù)據(jù)外標(biāo)法定量，得到8種雌激素的校正曲線。數(shù)據(jù)表明，8種雌激素在0.5～50 ng/ml范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2＞0.99。這里以雌二醇和苯甲酸雌二醇為例（見圖3），展示校正曲線范圍和線性。

圖3 雌二醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

分別選取苜蓿和生鮮乳作為基質(zhì)，驗(yàn)證方法準(zhǔn)確性。取空白基質(zhì)添加0.05、0.5、1.0 μg/kg 3個添加水平上（見圖4和圖5），每個水平重復(fù)5次得到的平均回收率在67.2%～103.4%之間（見表4），相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.39%～5.97%之間（見表5）。除雌三醇外，表4中展示的重現(xiàn)性基本滿足實(shí)驗(yàn)室80%～120%的需求。表5中展示相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的數(shù)據(jù)，可見重現(xiàn)性良好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度高，適合實(shí)驗(yàn)室日常定量檢測。

圖4 生鮮乳中添加8種雌激素負(fù)離子模式總離子流圖

圖5 苜蓿中添加8種雌激素正離子模式總離子流圖

表4 不同添加水平下不同雌激素的回收率（%）

表5 不同添加水平下不同雌激素的重現(xiàn)性（%）

2.4 靈敏度（見圖6）

圖6 部分化合物在0.1 ng/ml時的S/N

逐步稀釋雌激素的上機(jī)濃度達(dá)到最低檢出限，按照S/N＞3計(jì)算，8種雌激素在0.005 ng/ml時接近LOD，設(shè)定為8種雌激素的最低檢出限。按照S/N＞10計(jì)算，8種雌激素最低定量下限為0.01 ng/ml。圖6中展示部分化合物根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)要求最低檢出限0.1 ng/ml時的S/N。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，以上分析方法得到的靈敏度非常高，能夠滿足分析飼料類樣品的靈敏度要求。

3 結(jié)論

本研究通過對儀器的質(zhì)譜條件和色譜條件的優(yōu)化，以及樣品前處理方法的選擇，建立了雌二醇、雌三醇、雌酮、炔雌酮、苯甲酸雌二醇、己烯雌酚、己二烯雌酚和染料木素等8種激素的多殘留高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的分析方法，用生鮮乳和苜蓿驗(yàn)證檢測，得出該方法分析時間短，重現(xiàn)性好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度高，檢出限低，節(jié)約成本，提高了檢測效率。該分析方法可用于對生鮮乳和飼料中激素類物質(zhì)的摸底排查。