王斯璐 吳存造 潘曉東 洪煒龍 林成成 陳必成 白永恒

●論 著

白藜蘆醇對(duì)TGF-β1介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和Hedgehog信號(hào)的影響

王斯璐 吳存造 潘曉東 洪煒龍 林成成 陳必成 白永恒

目的 探討白藜蘆醇（Res）對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E）表型轉(zhuǎn)化（EMT）的影響及其分子機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞，分為對(duì)照組、誘導(dǎo)組（TGF-β1：5μg/L）、干預(yù)1組（TGF-β1+Res10μmol/ml）和干預(yù)2組（TGF-β1+Res100μmol/ml）。采用細(xì)胞免疫熒光和qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)EMT、細(xì)胞外基質(zhì)和Hedgehog信號(hào)相關(guān)分子表達(dá)水平。結(jié)果 TGF-β1作用NRK-52E細(xì)胞后，不僅促進(jìn)其受體TGF-β1R表達(dá)（P＜0.05），且肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物（α-SMA）和基質(zhì)成分Ⅲ型膠原的表達(dá)增加，上皮細(xì)胞標(biāo)志物（E-cadherin）表達(dá)下降。應(yīng)用Res干預(yù)后，不僅抑制甚至逆轉(zhuǎn)了上述結(jié)果，且抑制了TGF-β1介導(dǎo)的MMP-2/TIMP-2比值下降（P＜0.05），促進(jìn)基質(zhì)成分降解。此外，Res也抑制TGF-β1誘導(dǎo)的PCNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），以及增殖相關(guān)的Hedgehog信號(hào)（Shh、Ptch1和Gli1）活化（P＜0.05）。結(jié)論 Res可能通過(guò)拮抗Hedgehog信號(hào)來(lái)抑制TGF-β1所誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞增殖、EMT和細(xì)胞外基質(zhì)累積。

白藜蘆醇 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1 表型轉(zhuǎn)化 腎小管上皮細(xì)胞 Hedgehog信號(hào)

腎小管細(xì)胞上皮間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化（EMT）是指在某些特殊的生理或病理?xiàng)l件下，腎小管上皮細(xì)胞異常增殖，失去自身的細(xì)胞特性而獲得肌成纖維細(xì)胞的特性?；罨募〕衫w維細(xì)胞可以過(guò)度分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分，如Ⅰ型和Ⅲ型膠原在腎間質(zhì)間隙累積，從而導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生[1]。因此，抑制或逆轉(zhuǎn)EMT的發(fā)生和發(fā)展以及改善腎間質(zhì)成份的累積已成為控制腎間質(zhì)纖維化的重要途徑之一[2]。近年有研究顯示，從葡萄皮中分離的一種成分白藜蘆醇（Res）具有抑制多種組織纖維化的作用[3]，然而其分子機(jī)制尚未明確。目前，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）被證實(shí)可以調(diào)節(jié)EMT過(guò)程，且是最重要的誘導(dǎo)因子之一[4]。因此，本研究擬通過(guò)TGF-β1來(lái)誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E）EMT和基質(zhì)累積，探討Res對(duì)NRK-52E的EMT和細(xì)胞增殖相關(guān)的Hedgehog信號(hào)的影響及其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料及儀器 大鼠腎小管上皮細(xì)胞系（NRK-52E）購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。主要試劑：Res（上海源葉生物公司）、TGF-β1（美國(guó)PeproTech公司）、Ⅲ型膠原

和增殖細(xì)胞核抗原PCNA抗體（中國(guó)Bioworld公司）；上皮細(xì)胞標(biāo)志物鈣黏蛋白（E-cadherin）（美國(guó)Abcam公司）；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、patched-1（Ptch1）、Gli1和smoothened（Smo）抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）、TRIzol reagent（美國(guó) Invitrogen公司）、ReverTra Ace qPCR RT kit（日本Toyobo公司）、SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus（日本Toyobo公司）、引物由美國(guó)Invitrogen公司合成，見(jiàn)表1。主要儀器：7500 Real-Time PCR System（美國(guó)LifeTechnologies公司）、MyCycler梯度PCR儀（美國(guó)BioRed公司）、DM4000B LED熒光正置顯微鏡（德國(guó)Leica公司）。

1.2 方法

表1 Hedgehog信號(hào)和纖維化相關(guān)基因的mRNA特異性引物

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 NRK-52E細(xì)胞于DMEM（含5%胎牛血清、100U/ml penicillin和100mg/ml streptomycin）培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)。當(dāng)6孔板中細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)將完全培養(yǎng)基替換成無(wú)血清培養(yǎng)基，同步24h后加入TGF-β1或Res。根據(jù)文獻(xiàn)[5]將NRK-52E細(xì)胞分為4組：（1）對(duì)照組：未加入Res和TGF-β1；（2）誘導(dǎo)組：只加入TGF-β1（5μg/ L）；（3）干預(yù)1組：TGF-β1+Res10μmol/ml，干預(yù)2組：TGF-β1+Res100μmol/ml。

1.2.2 細(xì)胞免疫熒光染色 NRK-52E細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞爬片，TGF-β1或Res處理24h后，加入4%多聚甲醛固定，之后加入0.1%Triton X-100破膜處理10min，并用10%FBS封閉來(lái)消除非特性的熒光顯色。應(yīng)用PCNA（細(xì)胞增殖的關(guān)鍵蛋白）、Ⅲ型膠原（基質(zhì)成分）、α-SMA（肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物）、E-cadherin（上皮標(biāo)志物）、Ptch1、Smo和Gli1（Hedgehog信號(hào)通路成分）的一抗，以及DyLight 488/594標(biāo)記的二抗處理后，用抗淬滅封片劑封片，最后置于熒光顯微鏡下觀(guān)察并拍照。

1.2.3 qRT-PCR 用TRIzolreagent提取細(xì)胞總RNA，并于260/280nm測(cè)定吸光度值，分析樣本純度和濃度，再用ReverTra Ace qPCR RT kit將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后用SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，PCR程序?yàn)椋?5℃3min預(yù)變性，1個(gè)循環(huán)；95℃5s，60℃35s，40個(gè)循環(huán)。應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，以β-actin作為內(nèi)參對(duì)照。得到的結(jié)果用ΔΔCt法分析。相對(duì)表達(dá)量=2－ΔΔCt，ΔΔCt=[Ct目的基因（待測(cè)樣品）-Ct內(nèi)參（待測(cè)樣品）]-[Ct目的基因（校正樣品）-Ct內(nèi)參（校正樣品）]。同時(shí)采用熔解曲線(xiàn)分析以評(píng)價(jià)PCR結(jié)果的可靠性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Res對(duì)TGF-β1處理的NRK-52E細(xì)胞的EMT和基質(zhì)的影響 見(jiàn)插頁(yè)圖1和表2。

由圖1可見(jiàn)，免疫熒光染色結(jié)果顯示，TGF-β1處理NRK-52E細(xì)胞后，肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA和基質(zhì)成分Ⅲ型膠原表達(dá)增加，上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下降。由表2可見(jiàn)，TGF-β1不僅誘導(dǎo)使其受體TGF-β1R mRNA的表達(dá)升高（P＜0.05），而且也促進(jìn)纖連蛋白、S100A4、Ⅰ型膠原和TIMP-2 mRNA表達(dá)水平顯著上升和MMP-2 mRNA表達(dá)下降（P＜0.05或0.01）。低濃度的Res（10μmol/ml）即可抑制甚至逆轉(zhuǎn)以上結(jié)果，而高濃度的Res（100μmol/ml）對(duì)EMT和基質(zhì)的影響更顯著。

表2 EMT和細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)分子表達(dá)

2.2 Res對(duì)TGF-β1處理的NRK-52E細(xì)胞的PCNA表達(dá)的影響 見(jiàn)插頁(yè)圖2。

免疫熒光染色檢測(cè)PCNA表達(dá)顯示：PCNA陽(yáng)性/總細(xì)胞數(shù)分別為對(duì)照組0.68±0.13、誘導(dǎo)組0.77±0.15，干預(yù)1組0.35±0.06，干預(yù)2組0.30±0.05。誘導(dǎo)組PCNA的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組略微增加；干預(yù)1組、干預(yù)2組PCNA的表達(dá)低于誘導(dǎo)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）?？梢?jiàn)TGF-β1作用NRK-52E細(xì)胞后，PCNA的表達(dá)量增加。而Res可以抑制TGF-β1引起的NRK-52E細(xì)胞PCNA表達(dá)水平上調(diào)。

2.3 Res對(duì)TGF-β1處理的NRK-52E細(xì)胞的SHH信號(hào)相關(guān)分子表達(dá) 見(jiàn)插頁(yè)圖3及表3。

表3SHH信號(hào)相關(guān)分子表達(dá)

由圖3可見(jiàn)，TGF-β1能上調(diào)受體Smo和轉(zhuǎn)錄因子Gli1的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)細(xì)胞膜受體Ptch1的表達(dá)，而Res抑制甚至逆轉(zhuǎn)以上結(jié)果。由表3可見(jiàn)，TGF-β1能上調(diào)分泌型蛋白配體Shh和Gli1的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)Ptch1的表達(dá)（均P＜0.05），而Res抑制了Shh和Gli1的表達(dá)，上調(diào)Ptch1的表達(dá)（均P＜0.05）。

3 討論

腎間質(zhì)纖維化的病理學(xué)特征表現(xiàn)為基質(zhì)成分的合成和降解的失衡，導(dǎo)致其在腎間質(zhì)的廣泛累積[1，6]。肌成纖維細(xì)胞是體內(nèi)最主要的基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞，而肌成纖維細(xì)胞可能來(lái)源于EMT。因此，研究EMT對(duì)于腎纖維化防治具有十分重要的意義。本研究中，NRK-52E細(xì)胞經(jīng)TGF-β1處理后，上皮細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)下降，而肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物和基質(zhì)成分的表達(dá)明顯增高，說(shuō)明TGF-β1成功誘導(dǎo)了腎小管上皮細(xì)胞的EMT和基質(zhì)累積。

Res是一種含有芪類(lèi)結(jié)構(gòu)的植物抗毒素，從葡萄或者其他水果的表皮上即可分離得到。Res不僅具有抗炎、抗氧化和抑制血小板凝集等生物學(xué)活性[7]，而且也可抑制多種組織的纖維化[3]。然而，Res抗纖維化的分子機(jī)制尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞中，TGF-β1引起的EMT和基質(zhì)改變可以被低濃度的（10μmol/ml）Res所抑制甚至逆轉(zhuǎn)，而100μmol/ml Res的影響更為顯著，表明了Res對(duì)TGF-β1處理的NRK-52E細(xì)胞的EMT和基質(zhì)的影響可能呈現(xiàn)為濃度依賴(lài)性。TIMP-2和MMP-2屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族，在正常生理情況下如胚胎發(fā)育和組織重建中參與基質(zhì)的降解[8]。Res可以抑制TGF-β1引起的MMP-2/TIMP-2比值的下降，提示Res抑制細(xì)胞外基質(zhì)的累積是通過(guò)促使基質(zhì)降解和抑制其合成，最終使基質(zhì)成分減少，減輕腎纖維化[6]。Yang等[9]研究表明異常的細(xì)胞增殖可能是引起EMT的重要原因。我們研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1處理NRK-52E細(xì)胞后，增殖細(xì)胞核抗原PCNA表達(dá)上升，然而我們并未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量的增多，這說(shuō)明PCNA表達(dá)升高主要是細(xì)胞的異常增殖過(guò)程，即發(fā)生EMT，形成新的亞型。而Res則能使PCNA表達(dá)顯著下降，我們推測(cè)Res抑制EMT進(jìn)程可能和調(diào)控細(xì)胞增殖的Hedgehog信號(hào)通路相關(guān)。Hedgehog信號(hào)是一條與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的信號(hào)通路，該通路主要由分泌型蛋白配體Shh、細(xì)胞膜受體Ptch和Smo以及轉(zhuǎn)錄因子Gli構(gòu)成，在細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育及組織修復(fù)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10]。以前研究發(fā)現(xiàn)Res可以通過(guò)抑制胰腺癌細(xì)胞中的Hedgehog信號(hào)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡從而發(fā)揮抗腫瘤作用[5]。Huang等[11]發(fā)現(xiàn)Res通過(guò)調(diào)控SHH信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的分化。這些研究結(jié)果表明了Hedgehog信號(hào)與腫瘤等增殖性疾病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。本研究結(jié)果顯示，TGF-1能上調(diào)Shh、Smo和Gli1蛋白的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)Ptch1表達(dá)，這說(shuō)明TGF-β1能誘導(dǎo)Hedgehog信號(hào)的活化。而活化的Hedgehog信號(hào)可能是上皮細(xì)胞的異常增殖的關(guān)鍵。Res通過(guò)調(diào)控上皮細(xì)胞的異常增殖進(jìn)而影響EMT進(jìn)程，那么Res是否參與Hedgehog信號(hào)的調(diào)控？結(jié)果顯示Res增加了Ptch1的表達(dá)，下調(diào)了Smo和Gli1的表達(dá)，說(shuō)明Res可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞的Hedgehog信號(hào)活化。然而，本研究對(duì)Res對(duì)Hedgehog信號(hào)的調(diào)控方式以及作用靶點(diǎn)沒(méi)有深入研究。因此，需要進(jìn)一步明確Res和Hedgehog信號(hào)的關(guān)系，并深入探討其與TGF-β1和EMT等關(guān)系，為實(shí)現(xiàn)Res治療腎纖維化研究提供依據(jù)。綜上所述，Hedgehog信號(hào)通路可能參與Res抑制腎纖維化的過(guò)程，為Res對(duì)治療腎纖維化的臨床用藥提供理論依據(jù)。

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Effectof resveratrol on TGF-β1-mediated epithelial-mesenchymal transition and hedgehog signaling in renal tubular epithelialcells

WANG Silu,WU Cunzao,PAN Xiaodong,et al.
Laboratory of Surgery,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,China

Objective To investigate the effect of resveratrol(RES)on TGF-β1-mediated epithelial-mesenchymal transition(EMT)in renal tubular epithelial cells and its molecular mechanism. Methods Renal tubular epithelial NRK-52E cells were divided into control group,TGF-β1 group(EMT was induced by 5μg/L TGF-β1),treatment group 1 and 2(EMT-induced cells were treated with res 10 or 100μmol/ml).qRT-PCR and immunofluorescence staining were performed to evaluate the mRNA and protein expression of EMT,extracellular matrix,and Hedgehog signaling molecules. Results After treated with TGF-β1, NRK-52E cells were transited from epithelial phenotype to mesenchymal phenotype,accompanied with down-regulated expression of epithelial marker(E-cadherin)and up-regulated expression of TGF-β1R(P＜0.05),mesenchymal markers(α-SMA)and matrix components(TypeⅢcollagen),which were inhibited or reversed by resveratrol treatment.In addition,resveratrol inhibited TGF-β1-mediated down-regulation of MMP-2/TIMP-2,resulting in the degradation of matrix components.Resveratrol also abolished up-regulated expression of PCNA (P＜0.05),and activation of hedgehog signaling (Shh,Ptch1 and Gli1)induced by TGF-β1 in NRK-52E cells(P＜0.05). Conclusion Resveratrol can inhibit TGF-β1-induced proliferation,EMT and matrix deposition in NRK-52E cells via the hedgehog pathway.

ResveratrolTransforminggrowth factor β1(TGF-β1) Epithelial mesenchymal transition(EMT) Renal tubular epithelial cells Hedgehog signaling

2014-12-10）

（本文編輯：楊麗）

浙江省自然科學(xué)基金（LQ12H05001，LY12H05004）；溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20110028）

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院外科實(shí)驗(yàn)室（王斯璐、洪煒龍、林成成、陳必成、白永恒），移植科（吳存造、潘曉東）

白永恒，E-mail：greatsailor@163.com